人源Fab噬菌體抗體庫的構(gòu)建及Amylin抗體的篩選與鑒定.pdf

1、背景和目的:胰淀素是胰島β細胞分泌的一種激素，與胰島素共同貯存于胰島β細胞的分泌囊泡中，二者在葡萄糖及非糖激素刺激下以一定比例相伴釋放到胰島β細胞外?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)它是一個多效激素，以多重角色參與了機體的物質(zhì)及能量代謝過程。目前研究也表明胰淀素代謝異常可形成胰淀素聚集體，它是胰島淀粉樣蛋白變性纖維形成過程中的早期中間產(chǎn)物，參與了破壞胰島細胞雙層脂質(zhì)膜，最終導(dǎo)致胰島細胞凋亡的過程。因此其與2型糖尿病的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注，但是胰淀素的確切生物

2、學(xué)功能目前尚不完全清楚。由于胰淀素的分子量小、體內(nèi)含量低，給檢測其水平帶來了困難。用傳統(tǒng)制備抗體的方法，如雜交瘤技術(shù)和抗原免疫的方法得到的抗體少，且工作繁瑣，周期較長，制備出來的抗體缺乏穩(wěn)定性和特異性，給研究胰淀素在體內(nèi)的變化規(guī)律帶來了阻力。因此如何簡便、快速地制備胰淀素高純度的抗體是開展進一步研究的重要環(huán)節(jié)。
　　噬菌體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)為人源抗體的制備開辟了新的途徑，使得篩選潛在的人抗體片段成為可能性，較好的解決了抗體難制備的問

3、題。它是用基因工程的方法制備人源化抗體，是一種能從各種各樣的文庫中篩選高質(zhì)量人源性抗體的穩(wěn)定而簡便的技術(shù)。這種技術(shù)不經(jīng)免疫，繞過雜交瘤技術(shù)，直接利用抗原從抗體庫中篩選特異性抗體，較好地解決了人雜交瘤技術(shù)低效及人體排異反應(yīng)的難題。本研究采用噬菌體表面展示技術(shù)在本室構(gòu)建的抗體庫[1]的基礎(chǔ)上進行了引物及載體的改良，重新構(gòu)建了一個庫容量更大、多樣性更好的人源Fab噬菌體抗體庫，建立了人源抗體制備技術(shù)平臺，用于制備人源化的胰淀素抗體，為下一步進

4、行抗體的表達、純化、大量制備以及進一步的臨床應(yīng)用研究提供可行的方法。
　　方法:從正常健康人的外周血中分離淋巴細胞，提取總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法擴增人抗體重鏈Fd段和輕鏈基因。輕鏈PCR產(chǎn)物和噬菌粒載體pComb3XSS分別經(jīng)SacⅠ/XbaⅠ雙酶切，由T4 DNA連接酶連接，電穿孔轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue，擴增后提取噬菌粒，構(gòu)建輕鏈庫。輕鏈庫噬菌粒DNA和重鏈Fd段PCR產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ/SpeⅠ雙酶切

5、，以同樣方法連接后轉(zhuǎn)化XL1-Blue，加入輔助噬菌體VCSM13，構(gòu)建噬菌體抗體庫。隨機挑取10個克隆酶切鑒定有無插入片段;并以提取的噬菌體抗體庫噬粒DNA為模板，以輕、重鏈不同引物組合進行PCR擴增。以胰淀素為抗原對構(gòu)建的抗體庫進行3輪篩選。Phage-ELISA鑒定胰淀素特異性噬菌體抗體并選取陽性克隆測定輕鏈、重鏈(Fd)DNA序列并進行同源性分析。
　　結(jié)果:最終構(gòu)建的抗體庫庫容達0.8×108 pfu/ml，重組率為70

6、％，酶切和PCR顯示有插入片段。以胰淀素為抗原對抗體庫進行3輪篩選，抗體庫滴度增加了約22倍，說明攜帶抗胰淀素抗體的特異性噬菌體得到了明顯富集。Phage-ELISA法測定其抗原結(jié)合活性，其中一個陽性克隆經(jīng)DNA測序分析，結(jié)果顯示與胰淀素特異結(jié)合的噬菌體抗體的重鏈核苷酸序列與人免疫球蛋白γ鏈同源性為88％，輕鏈核苷酸序列與λ鏈同源性為93％。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了一個人源Fab噬菌體抗體庫，為今后篩選制備各種抗體提供了技術(shù)平臺。成