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文檔簡介
1、背景和目的:胰淀素是胰島β細胞分泌的一種激素,與胰島素共同貯存于胰島β細胞的分泌囊泡中,二者在葡萄糖及非糖激素刺激下以一定比例相伴釋放到胰島β細胞外?,F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)它是一個多效激素,以多重角色參與了機體的物質(zhì)及能量代謝過程。目前研究也表明胰淀素代謝異??尚纬梢鹊硭鼐奂w,它是胰島淀粉樣蛋白變性纖維形成過程中的早期中間產(chǎn)物,參與了破壞胰島細胞雙層脂質(zhì)膜,最終導致胰島細胞凋亡的過程。因此其與2型糖尿病的關系受到越來越多的關注,但是胰淀素的確切生物
2、學功能目前尚不完全清楚。由于胰淀素的分子量小、體內(nèi)含量低,給檢測其水平帶來了困難。用傳統(tǒng)制備抗體的方法,如雜交瘤技術和抗原免疫的方法得到的抗體少,且工作繁瑣,周期較長,制備出來的抗體缺乏穩(wěn)定性和特異性,給研究胰淀素在體內(nèi)的變化規(guī)律帶來了阻力。因此如何簡便、快速地制備胰淀素高純度的抗體是開展進一步研究的重要環(huán)節(jié)。
噬菌體抗體庫技術的出現(xiàn)為人源抗體的制備開辟了新的途徑,使得篩選潛在的人抗體片段成為可能性,較好的解決了抗體難制備的問
3、題。它是用基因工程的方法制備人源化抗體,是一種能從各種各樣的文庫中篩選高質(zhì)量人源性抗體的穩(wěn)定而簡便的技術。這種技術不經(jīng)免疫,繞過雜交瘤技術,直接利用抗原從抗體庫中篩選特異性抗體,較好地解決了人雜交瘤技術低效及人體排異反應的難題。本研究采用噬菌體表面展示技術在本室構(gòu)建的抗體庫[1]的基礎上進行了引物及載體的改良,重新構(gòu)建了一個庫容量更大、多樣性更好的人源Fab噬菌體抗體庫,建立了人源抗體制備技術平臺,用于制備人源化的胰淀素抗體,為下一步進
4、行抗體的表達、純化、大量制備以及進一步的臨床應用研究提供可行的方法。
方法:從正常健康人的外周血中分離淋巴細胞,提取總RNA,以逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法擴增人抗體重鏈Fd段和輕鏈基因。輕鏈PCR產(chǎn)物和噬菌粒載體pComb3XSS分別經(jīng)SacⅠ/XbaⅠ雙酶切,由T4 DNA連接酶連接,電穿孔轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue,擴增后提取噬菌粒,構(gòu)建輕鏈庫。輕鏈庫噬菌粒DNA和重鏈Fd段PCR產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ/SpeⅠ雙酶切
5、,以同樣方法連接后轉(zhuǎn)化XL1-Blue,加入輔助噬菌體VCSM13,構(gòu)建噬菌體抗體庫。隨機挑取10個克隆酶切鑒定有無插入片段;并以提取的噬菌體抗體庫噬粒DNA為模板,以輕、重鏈不同引物組合進行PCR擴增。以胰淀素為抗原對構(gòu)建的抗體庫進行3輪篩選。Phage-ELISA鑒定胰淀素特異性噬菌體抗體并選取陽性克隆測定輕鏈、重鏈(Fd)DNA序列并進行同源性分析。
結(jié)果:最終構(gòu)建的抗體庫庫容達0.8×108 pfu/ml,重組率為70
6、%,酶切和PCR顯示有插入片段。以胰淀素為抗原對抗體庫進行3輪篩選,抗體庫滴度增加了約22倍,說明攜帶抗胰淀素抗體的特異性噬菌體得到了明顯富集。Phage-ELISA法測定其抗原結(jié)合活性,其中一個陽性克隆經(jīng)DNA測序分析,結(jié)果顯示與胰淀素特異結(jié)合的噬菌體抗體的重鏈核苷酸序列與人免疫球蛋白γ鏈同源性為88%,輕鏈核苷酸序列與λ鏈同源性為93%。
結(jié)論:成功構(gòu)建了一個人源Fab噬菌體抗體庫,為今后篩選制備各種抗體提供了技術平臺。成
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