人源性抗核抗體Fab片段抗體庫的構(gòu)建篩選及鑒定.pdf

1、研究背景與目的： 腫瘤是當(dāng)前人類健康與生命的最大威脅，發(fā)生率有增無減，死亡率已躍居諸病種之首。目前人類對于腫瘤的本質(zhì)缺乏足夠的認(rèn)識，通常認(rèn)為腫瘤是多因素、多發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜疾病，主要采用手術(shù)、放療、化療、生物治療等手段進(jìn)行綜合治療。手術(shù)是早期腫瘤治療的重要手段，但相對于腫瘤這一全身性疾病而言，具有無法克服的局限性?；熀头暖熞恢笔侨藗冎委熌[瘤特別是中晚期腫瘤的主要武器，但是這兩種療法缺乏特異性，因此，雖然具有一定的療效，但患者生活

2、質(zhì)量差，常常因為無法耐受其毒副作用而停止治療。此外，腫瘤細(xì)胞對化放療敏感性的逐漸降低及隨之而來的高復(fù)發(fā)率也阻礙了這兩種治療手段成為攻克腫瘤的最終方法。腫瘤的分子靶向治療是近年來研究的熱點和亮點，是根本意義上的腫瘤特異性治療手段，其中單克隆抗體是這一領(lǐng)域的基石。 選擇與惡性腫瘤抗原特異性結(jié)合的單克隆抗體，利用基因工程手段進(jìn)行商業(yè)化大量生產(chǎn)，然后連接上對腫瘤有殺傷性的負(fù)載如放射性核素131I，這種具有靶向性的放療技術(shù)叫做生物導(dǎo)向治療

3、技術(shù)或放射免疫治療(Radioimmunotherapy,RIA)，具有靶向性好、毒性小等優(yōu)點，非常適合用于腫瘤的內(nèi)放射治療。多年來，人們嘗試過采用針對腫瘤細(xì)胞膜抗原的單克隆抗體進(jìn)行放射免疫治療，但是針對腫瘤細(xì)胞膜抗原的單克隆抗體存在如下各種問題：①目前還沒有發(fā)現(xiàn)所有腫瘤共同的抗原，不管是腫瘤特異性抗原(TSA)還是腫瘤相關(guān)性抗原(TAA)，都只表達(dá)于部分腫瘤，因此，對不同的腫瘤需要不同的單克隆抗體；②由于腫瘤的不均質(zhì)性，只有部分腫瘤細(xì)

4、胞表面表達(dá)抗原，該類單抗注入體內(nèi)后，只有少量單抗聚集在腫瘤部位，導(dǎo)致放射性核素積聚較少；③抗原調(diào)變：腫瘤細(xì)胞表達(dá)某抗原一段時間后，不再表達(dá)該抗原，而可能表達(dá)另一種抗原。因此抗腫瘤細(xì)胞膜抗原的單抗用于實體瘤的治療效果不夠理想，尋找新的腫瘤抗原、探索治療實體瘤的新方法就顯得十分必要。 研究人員發(fā)現(xiàn)，盡管癌細(xì)胞和正常細(xì)胞之間有許多相似的特性使得我們的治療手段左右為難，但它們之間仍然存在明顯的差異。在不同階段的細(xì)胞變化周期中，癌組織中變

5、性和死亡細(xì)胞占據(jù)很高的比例，同時胞膜完整性喪失，細(xì)胞膜表面滲透性異常。而正常組織只有很少細(xì)胞以很慢的速度壞死，且壞死的細(xì)胞會快速有序地被組織清除，它們在死亡過程中只有核碎裂，沒有異常的膜滲透改變。以往的治療均著眼于殺死活的癌細(xì)胞，忽略了變性壞死細(xì)胞。經(jīng)過測算發(fā)現(xiàn)，與正常組織不同，50％左右的腫瘤細(xì)胞在分裂后很快出現(xiàn)變性。由于腫瘤中血供不足及巨噬細(xì)胞反應(yīng)異常，使變性細(xì)胞越來越多，在腫瘤中心位置形成大片壞死區(qū)，成為惡性實體腫瘤的典型特征。

6、 利用惡性實體腫瘤的這一病理特征，研究人員提出了與之相對應(yīng)的一種新的腫瘤治療模式：腫瘤壞死治療(TumorNecrosisTherapy，TNT)。YNT屬于腫瘤分子靶向治療的范疇，其基本原理是利用腫瘤組織的微血管內(nèi)皮細(xì)胞的不連續(xù)性，基底膜的不完整性和腫瘤細(xì)胞膜的高通透性特點，應(yīng)用能與細(xì)胞內(nèi)核抗原成份結(jié)合的靶向分子攜帶殺瘤物質(zhì)，滯留或定位于腫瘤組織內(nèi)，造成腫瘤的特異性殺傷。這些靶向分子主要是抗細(xì)胞核內(nèi)某些組份的抗體，殺瘤物質(zhì)為放射

7、性核素、藥物、毒素或某些抗瘤細(xì)胞因子等。瘤細(xì)胞殺傷后釋出的靶向分子又可進(jìn)入相鄰的瘤組織造成進(jìn)一步的殺傷，如此使殺瘤范圍不斷擴(kuò)大，直至正常組織細(xì)胞。由于TNT靶向分子在正常組織中的高清除、低滯留，因而在保證較好殺瘤效果的同時，對周圍正常組織的損傷卻很小。 腫瘤細(xì)胞核人鼠嵌合單抗(chTNT)是Peregrine開發(fā)成功的一種針對腫瘤壞死組織的新型抗體，具有明確的抗腫瘤作用，但是，其作為一種鼠／人嵌合單抗必然有其自身的不足。鼠源抗體

8、的人源化是一項比較繁雜的技術(shù)，而且仍然存在一定程度的宿主抗體反應(yīng)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，單克隆抗體必然要經(jīng)歷從鼠源單抗、鼠／人嵌合單抗、人源化單抗到全人單抗的發(fā)展階段。因此，作為臨床治療用抗體，相對于嵌合抗體與人源化抗體而言，全人源抗體無疑是最佳的選擇。目前，以抗體庫技術(shù)和人-人雜交瘤技術(shù)為手段的全人源抗體的制備技術(shù)已經(jīng)較為成熟，因此有必要通過此類技術(shù)制備以腫瘤壞死區(qū)變性壞死細(xì)胞核為靶點的可用于TNT的全人源化單克隆抗體。Fab片段擁有重

9、鏈Fd基因與完整的輕鏈基因，這種小分子抗體保持了抗體活性，大小為完整IgG的1／3。因其不含有Fc段，分子量小，免疫原性低，組織穿透力相對較強(qiáng)，故在腫瘤治療上有其優(yōu)越性，適合用于TNT治療。 本研究擬構(gòu)建抗核抗體Fab片段噬菌體組合文庫，并利用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)(PhageDisplay)篩選(Panning)針對雙鏈DNA的人源性抗核抗體Fab片段，為進(jìn)一步的放免靶向治療奠定基礎(chǔ)。 研究方法： 1)從4名間接免

10、疫熒光法檢測抗核抗體(均質(zhì)型)滴度大于1:10000的自身免疫病患者外周血中分離單個核細(xì)胞(PBMNC)，抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA文庫。 2)以獲取的cDNA文庫為模版，PCR法擴(kuò)增輕鏈κ、λ基因及免疫球蛋白分子重鏈Fd基因。 3)將輕鏈克隆入pComb3Hss載體以構(gòu)建輕鏈文庫。 4)將重鏈基因載入κ/λ-pComb3Hss載體，構(gòu)建完成組合文庫。 5)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue，用

11、輔助噬菌體M13K07感染，隨機(jī)的組合文庫表達(dá)于絲狀噬菌體表面，完成噬菌體表面展示。 6)通過4輪淘篩，富集已構(gòu)建的人源性抗核抗體Fab噬菌體抗體庫，間接ELISA法鑒定4輪淘篩后抗核抗體Fab噬菌體抗體，提取陽性克隆的噬菌粒DNA，切除gIII基因片段，自連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)可溶性人源性抗核抗體Fab片段；應(yīng)用間接ELISA法及熒光免疫法對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。 7)制備用于純化人IgGF

12、ab片段的親和層析柱。 8)利用制備的親和層析柱純化人源性抗核抗體Fab片段。 9)Westernblotting及間接免疫熒光法鑒定純化產(chǎn)物。 實驗結(jié)果： 1)從外周血單個核細(xì)胞中抽提得到總RNA，并成功反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA文庫。 2)PCR法擴(kuò)增了大小均為660bp左右的輕鏈κ、λ基因及重鏈Fd基因，并成功構(gòu)建了庫容為2×104的輕鏈基因抗體庫(輕鏈庫)和庫容為4×104的人Fab抗體庫(組合文

13、庫)。 3)通過噬菌體表面展示技術(shù)，在組合文庫的基礎(chǔ)上獲得了噬菌體滴度為2×109pfu／ml的富含人源性抗核抗體Fab片段的噬菌體抗體庫。 4)通過固相化抗原吸附篩選法篩選獲得2個陽性克隆，切除gIII基因片段，實現(xiàn)了可溶性人源性抗核抗體Fab片段的表達(dá)。 5)間接ELISA法檢測結(jié)果顯示：制備的可溶性人源性抗核抗體Fab片段呈現(xiàn)抗dsDNA陽性，抗核糖核蛋白陰性;間接免疫熒光法結(jié)果顯示：Hep2細(xì)胞和猴肝臟組

14、織細(xì)胞核顯示均質(zhì)型熒光，綠蠅短膜蟲的動基體顯示均質(zhì)型熒光。證實獲得的可溶性人源性抗核抗體Fab片段具有特異性結(jié)合雙鏈DNA的免疫學(xué)活性。 6)制備完成可用于純化人IgGFab片段的親和層析柱。 7)利用制備的親和層析柱純化獲得一定濃度和數(shù)量的人源性抗核抗體Fab片段，經(jīng)Westernblotting證實為人IgGFab片段，間接免疫熒光法明確其具有一定的抗dsDNA的免疫學(xué)活性。 結(jié)論： 通過自身免疫性疾