抗炭疽人源化抗體的研究.pdf

1、炭疽是由炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)引起的人畜共患的重大烈性傳染病。炭疽芽孢作為A類生物戰(zhàn)劑,由于其強烈的致病力及其對環(huán)境的極強適應(yīng)能力等特性,一直是生物戰(zhàn)/生物恐怖的首選,也是重大的威脅。因此,炭疽防控是防生/反恐的重要研究目標(biāo)。對于炭疽有效的治療措施主要有二大類:一類是炭疽桿菌的抑菌劑和殺菌劑,其中包括抗菌素和噬菌體的溶菌成分;另一類是依據(jù)炭疽病理模型設(shè)計的毒素抑制劑,主要包括炭疽毒素中和抗體、可溶性受體、毒

2、素突變體和小分子拮抗劑。對吸入性炭疽的治療抗菌素雖然有效,但必須在感染初期立即使用,存在一定的缺陷。具有中和活性的抗體作為被動免疫制劑可以直接提供有效的保護,其因為具有保護性高,在人體內(nèi)可以發(fā)揮特有的補體依賴的細胞毒(complement dependent cytotoxicity,CDC)和抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒(Antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC)免疫反應(yīng),半衰期

3、長,性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點,成為目前最有前景的炭疽毒素抑制劑。
　　本研究的目標(biāo)是基于國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀和研究室的基礎(chǔ),期望研制新型炭疽特異性治療藥物。研究內(nèi)容包括首先對抗PA鼠源單抗進行人源化改造以降低鼠單抗的異源性,然后利用中國倉鼠卵巢(chinese hamster ovary,CHO)細胞表達系統(tǒng)規(guī)?；苽淙嗽椿贵w,并對純化的人源化抗體進行體內(nèi)外效力學(xué)研究。
　　首先應(yīng)用抗體“框架區(qū)重塑”技術(shù),對本室制備并保存的鼠源單克隆抗

4、體(mAb)的框架區(qū)進行了人源化。通過Kabat數(shù)據(jù)庫對獲得的鼠源單抗進行框架區(qū)(framework region, FR)和互補決定區(qū)(complementarity determinative region, CDR)的劃分。保持CDR區(qū)氨基酸不變,對FR序列進行最大同源性檢索,選擇與框架區(qū)同源性最高的人源序列?？紤]到CDR相鄰的3個氨基酸可能對構(gòu)象有影響,對個別關(guān)鍵氨基酸進行了保留。人源化程度分別達到了95.35％和95.77％(

5、氨基酸序列的同源性)。然后構(gòu)建了帶His標(biāo)簽的人源化單鏈抗體的原核表達質(zhì)粒,在大腸桿菌中表達了人源化單鏈抗體,亞細胞定位實驗顯示,表達產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在,超聲后的包涵體經(jīng)洗滌、變性后經(jīng)過Ni離子螯合柱純化,ScFv純度達90％以上。經(jīng)梯度透析法復(fù)性得到了人源化的單鏈抗體,并在毒素作用的J774A.1細胞模型上對其生物學(xué)活性進行了初步評價,實驗證明人源化單鏈抗體具有一定的中和活性,為進一步制備具有生物學(xué)功能的全分子人源化抗體奠定了

6、實驗基礎(chǔ)。
　　本文選擇利用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)制備人源化全分子抗體。哺乳動物細胞是表達具有天然活性蛋白的最佳宿主,有很多其他體系不能與之相比的優(yōu)勢。用哺乳動物細胞表達產(chǎn)生的完整抗體和天然抗體一樣,具有生物學(xué)活性,既可識別抗原又可激活補體系統(tǒng)。目前,美國418種在研藥物中70％是由以CHO為主的哺乳動物細胞表達的。
　　為了獲得在CHO細胞中穩(wěn)定高表達的工程細胞株,我們嘗試了不同的信號肽及細胞系,分別構(gòu)建了四種信號肽的表達質(zhì)

7、粒包括 pMH3-EPO-HII/L、pMH3-tPA-HII/L、pMH3-ori-HII/L和pMH3-VH21-HII/L。將表達質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)染CHO-S及CHO-K1細胞,并用G418進行篩選,G418濃度為1.8mg/ml。一次克隆所得到的穩(wěn)定表達的細胞株經(jīng)過二次克隆篩選,最終發(fā)現(xiàn)pMH3-VH21-HII/LII在CHO-S細胞中的表達量較高,挑選高表達細胞株進行傳代培養(yǎng),最終得到可穩(wěn)定傳代的高表達細胞株。將得到的細胞株用無

8、血清培養(yǎng)基進行懸浮培養(yǎng),并逐級放大,最終在CURRENT AP200生物反應(yīng)器中進行規(guī)?；苽?發(fā)酵過程中監(jiān)測細胞密度、細胞活率、葡萄糖濃度、滲透壓、pH值和溶氧情況等指標(biāo),優(yōu)化培養(yǎng)條件,最終可以達到高于300mg/L的產(chǎn)量,反應(yīng)器中的細胞產(chǎn)率達到7.87pg/cell/day。62L的發(fā)酵液經(jīng)過離心、超濾濃縮后用Mab select sure親和層析介質(zhì)進行純化,最終可以得到13g以上的純品,HPLC測定抗體的純度大于95％,得率大于

9、60％。
　　表達的全分子人源化抗體在非還原SDS-PAGE中表現(xiàn)為一條約150kD的帶,在還原SDS-PAGE中表現(xiàn)為一條約50kD和一條約25kD的帶;Dot-Blot結(jié)果顯示,此人源化抗體可以與PA的結(jié)構(gòu)域2(非loop區(qū))發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。N末端氨基酸序列測定和分子量測定顯示獲得預(yù)期的人源化抗體。
　　在獲得預(yù)期的人源化抗體后,在體內(nèi)外模型上進行了效力學(xué)研究。在毒素作用的J774A.1細胞模型上,人源化抗體顯示良好

10、的保護活性,EC50為0.95μg/ml。在毒素作用的Fisher344大鼠模型上,如果毒素和抗體同時給藥,抗體和PA摩爾比為1:1時即可提供完全保護;抗體在毒素之后10min給藥,抗體與PA摩爾比為8:1即抗體給藥量為3.2mg/kg時,保護率達83.3％(5/6),而抗體在毒素之后20min和30min給藥,即使抗體量達到8mg/kg和32mg/kg,依然不能使大鼠存活,但可以延長大鼠的存活時間。在芽孢感染的家兔模型上,采用攻毒菌株