高血壓易感基因CYP4F2轉(zhuǎn)基因小鼠模型的鑒定及CYP4F2-20-HETE途徑的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 細(xì)胞色素P4504F2(cytochrome P4504F2,CYP4F2)通過(guò)ω-羥化作用將花生四烯酸(arachidonic acid,AA)代謝為20-羥基二十碳四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid,20-HETE),是人類腎臟產(chǎn)生20-HETE最主要的酶。20-HETE通過(guò)調(diào)節(jié)血管和腎小管的活性而影響動(dòng)脈血壓:一方面,20-HETE收縮外周血管,并增強(qiáng)其它血管活性物質(zhì)的縮血

2、管效應(yīng)而起促高血壓作用；另一方面,20-HETE抑制腎臟近端小管和髓袢升支粗段對(duì)鈉離子的重吸收而起抗高血壓作用。本課題組前期對(duì)遼寧省西部高血壓病高發(fā)區(qū)人群的關(guān)聯(lián)研究表明,CYP4F2基因調(diào)控區(qū)功能性多態(tài)上調(diào)了該基因轉(zhuǎn)錄活性,增強(qiáng)了代謝產(chǎn)物20-HETE的生成,與高血壓發(fā)病呈正相關(guān)。我們的結(jié)論與Ward等對(duì)白種人群報(bào)道的CYP4F2V433M多態(tài)與20-HETE生成增多及血壓升高呈正相關(guān)結(jié)論一致。然而,Gainer等則認(rèn)為20-HETE的

3、另一合酶CYP4A11 F434S多態(tài)性降低了轉(zhuǎn)錄活性,與高血壓呈負(fù)相關(guān)。因此,建立高血壓易感基因CYP4F2的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,將是從整體水平分析20-HETE對(duì)血壓的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制的重要手段。
　　 腎臟雄激素調(diào)節(jié)蛋白(kidney androgen-regulated protein,KAP)是小鼠腎臟近端小管表達(dá)的高豐度蛋白,與人CYP4F2在腎臟的表達(dá)部位基本一致。KAP啟動(dòng)子活性受雄激素、雌激素等多種激素的調(diào)節(jié),其中以

4、對(duì)雄激素的反應(yīng)性最為明顯。已有學(xué)者建立KAP-hAGT、KAP-LUC等轉(zhuǎn)基因小鼠模型,并成功地實(shí)現(xiàn)了雄激素對(duì)轉(zhuǎn)基因在小鼠腎臟的誘導(dǎo)表達(dá)。因此,選擇KAP啟動(dòng)子構(gòu)建CYP4F2轉(zhuǎn)基因小鼠模型,旨在強(qiáng)調(diào)CYP4F2在小鼠腎臟的優(yōu)勢(shì)表達(dá),兼顧20-HETE的雙重血壓調(diào)節(jié)作用,并為實(shí)現(xiàn)CYP4F2的雄激素誘導(dǎo)表達(dá)提供可行性。
　　 本研究通過(guò)建立CYP4F2轉(zhuǎn)基因小鼠模型,從整體水平鑒定CYP4F2/20-HETE代謝通路對(duì)血壓的調(diào)節(jié)

5、作用,并進(jìn)一步以該模型作為研究平臺(tái),借助雄激素誘導(dǎo)CYP4F2的表達(dá)及效應(yīng),為闡明CYP4F2/20-HETE對(duì)高血壓的具體調(diào)節(jié)機(jī)制提供有力的條件。
　　 材料與方法
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料:
　　 1、FVB/N小鼠
　　 2、人HEK293、HUVEC細(xì)胞系
　　 3、基因克隆及螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)相關(guān)試劑
　　 4、Southern blot、Western blot及免疫組化相關(guān)試劑<

6、br>　　 5、20-HET EELISA檢測(cè)、醛固酮放免檢測(cè)相關(guān)試劑
　　 6、Real-time PCR相關(guān)試劑
　　 7、ROS特異性熒光染料DHE及NO特異性熒光染料DAF-2 DA
　　 8、MDA及SOD檢測(cè)相關(guān)試劑
　　 9、氧化應(yīng)激基因mRNA芯片
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、構(gòu)建pKAP-LUC、pKAP-CYP4F2/his載體,轉(zhuǎn)染人腎臟細(xì)胞系HEK293,雙螢

7、光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)LUC活性,以CYP4F2抗體和his標(biāo)簽抗體Western blot檢測(cè)CYP4F2的表達(dá),細(xì)胞水平判斷KAP啟動(dòng)子活性。
　　 2、將pKAP-CYP4F2/his載體雙酶切線性化,膠回收純化轉(zhuǎn)基因片段,顯微注射至FVB/N小鼠受精卵,產(chǎn)生CYP4F2轉(zhuǎn)基因Founder小鼠。提取鼠尾DNA,以CYP4F2特異性探針及引物,經(jīng)Southern blot及PCR雙重鑒定陽(yáng)性小鼠,建立轉(zhuǎn)基因系。
　　

8、3、提取小鼠腎臟等十余種組織的總蛋白并定量,his標(biāo)簽抗體Western blot檢測(cè)CYP4F2的表達(dá)譜。以4％多聚甲醛固定腎臟等組織塊,石蠟切片,免疫組化鑒定CYP4F2的表達(dá)定位。提取腎臟微粒體蛋白,his標(biāo)簽抗體Western blot檢測(cè)CYP4F2在微粒體酶中的表達(dá)。
　　 4、將腎臟微粒體蛋白與AA底物、NADPH輔酶等成分孵育,建立體外的AA羥化反應(yīng)體系,ELISA試劑盒檢測(cè)20-HETE生成量。收集小鼠尿液,E

9、LISA試劑盒檢測(cè)尿20-HETE的水平。
　　 5、無(wú)創(chuàng)鼠尾血壓儀測(cè)量轉(zhuǎn)基因小鼠收縮壓(SBP),并抽樣以有創(chuàng)的頸動(dòng)脈插管法評(píng)估前種方法的有效性。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)8-40周齡小鼠的血壓變化情況。小鼠眶后靜脈叢采血并分離血漿及血清,放射免疫法測(cè)量血漿醛固酮水平,干片法測(cè)量血清肌酐(CRE)、尿素氮(BUN),判斷腎功能。
　　 6、對(duì)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠連續(xù)兩周腹腔注射雄激素誘導(dǎo)劑5α-雙氫睪酮(dihydrotestosterone

10、,DHT),his標(biāo)簽抗體Western blot檢測(cè)誘導(dǎo)后腎臟CYP4F2的表達(dá)情況。ELISA試劑盒檢測(cè)誘導(dǎo)后微粒體對(duì)AA羥化孵育反應(yīng)的20-HETE產(chǎn)量,并測(cè)量小鼠尿20-HETE的排泌水平。鼠尾動(dòng)脈血壓儀測(cè)量誘導(dǎo)后小鼠血壓的變化。
　　 7、對(duì)雄性轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)施去勢(shì)術(shù)清除內(nèi)源的雄激素分泌,再給與外源DHT誘導(dǎo)劑,分別檢測(cè)腎臟CYP4F2的表達(dá)、代謝產(chǎn)物20-HETE及小鼠血壓,并與誘導(dǎo)前加以比較。
　　 8、對(duì)小

11、鼠實(shí)施DHT及20-HETE特異性抑制劑HET0016共給藥,檢測(cè)尿20-HETE及動(dòng)脈血壓,進(jìn)一步確認(rèn)20-HETE在DHT誘導(dǎo)的高血壓中的作用。
　　 9、提取DHT誘導(dǎo)小鼠腎臟總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,Real-time PCR檢測(cè)DHT對(duì)小鼠內(nèi)源性20-HETE合酶cyp4a12、cyp4a14、cyp4a10的表達(dá)調(diào)控。
　　 10、以DHT分別刺激人HEK293細(xì)胞0.5小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí),CYP4F

12、2抗體Western blot檢測(cè)雄激素對(duì)人CYP4F2的誘導(dǎo)表達(dá)作用。
　　 11、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo):DHE染色法檢測(cè)胸主動(dòng)脈、腎臟冰凍切片活性氧自由基(ROS)、試劑盒檢測(cè)血漿及腎組織勻漿液脂質(zhì)過(guò)氧化標(biāo)記物丙二醛(MDA)、試劑盒檢測(cè)血漿及腎組織勻漿液總體超氧化物歧化酶(SOD)活力。
　　 12、以SOD類似物Tempol添加到飲水中抑制氧化應(yīng)激,檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠SBP的變化,確立氧化應(yīng)激對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠高

13、血壓發(fā)生的重要作用。
　　 13、提取腎臟總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過(guò)Real-time PCR儀進(jìn)行氧化應(yīng)激相關(guān)基因的mRNA芯片檢測(cè),篩查轉(zhuǎn)基因與野生型小鼠之間差異表達(dá)的氧化應(yīng)激基因。
　　 14、以芯片篩查的差異表達(dá)基因Nos2作為靶基因,對(duì)整個(gè)NOS家族的每個(gè)成員(iNOS、nNOS、eNOS),進(jìn)行Western blot驗(yàn)證小鼠腎臟蛋白質(zhì)水平的表達(dá)差異。
　　 15、體外培養(yǎng)人HUVEC、HEK2

14、93細(xì)胞系并施加20-HETE刺激,DHE熒光染料檢測(cè)ROS水平,分析20-HETE對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的誘發(fā)作用。DAF-FM熒光染料檢測(cè)NO水平,分析20-HETE對(duì)細(xì)胞整體NO水平的影響。
　　 結(jié)論
　　 1、成功地建立了高血壓易感基因CYP4F2的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,CYP4F2/20-HETE代謝通路功能性獲得,引起轉(zhuǎn)基因小鼠呈現(xiàn)慢性高血壓表型。因此,從整體水平證明CYP4F2/20-HETE起促高血壓作用。
　

15、　 2、雄激素明顯誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟CYP4F2的表達(dá),放大了CYP4F2/20-HETE通路的效應(yīng),并引起雄激素依賴性高血壓。雄激素對(duì)人腎臟細(xì)胞CYP4F2的誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)一步提示CYP4F2/20-HETE通路可能是人類高血壓性別差異的機(jī)制之一。
　　 3、轉(zhuǎn)基因小鼠氧化應(yīng)激水平明顯升高,抑制氧化應(yīng)激明顯改善了高血壓表型,氧化應(yīng)激相關(guān)基因存在較廣泛的表達(dá)差異,提示氧化應(yīng)激是CYP4F2轉(zhuǎn)基因小鼠高血壓發(fā)生的關(guān)鍵,參與了CYP