TGM6轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建和鑒定.pdf

1、脊髓小腦型共濟(jì)失調(diào)(spinocerebellar ataxia，SCA)是一種具有高度臨床和遺傳異質(zhì)性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，多呈常染色體顯性遺傳。隨著分子遺傳學(xué)的研究進(jìn)展，陸續(xù)鑒定出新的致病基因。到目前已發(fā)現(xiàn)了33個(gè)不同的基因亞型，其中23個(gè)亞型的致病基因已被克隆出來。2010年，我們實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用Exome sequencing技術(shù)在兩個(gè)無關(guān)的常染色體顯性遺傳家系中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)不同位置的突變:TGM6基因10號(hào)外顯子的c.1550T-G(L

2、517W)突變和7號(hào)外顯子c.980A-G(D327G)突變。從而鑒定出一個(gè)新的SCA致病基因TGM6，該SCA新亞型被人類基因命名委員會(huì)正式命名為SCA35。
　　SCA各亞型致病基因的分子發(fā)病機(jī)制并不完全一樣。TGM6基因本身的生物學(xué)功能目前國內(nèi)外尚無研究報(bào)道。為了探討TGM6的基本生物學(xué)功能以及突變引起SCA35的發(fā)病機(jī)制，我們構(gòu)建兩種突變型和野生型TGM6基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，使小鼠表達(dá)人類突變和野生的TG6蛋白。此外，目

3、前缺乏TGM6基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)胞水平表達(dá)譜的資料，而這些資料對(duì)于了解其功能是必需的。因此，本論文采用免疫組化方法調(diào)查了TGM6基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的分布情況及其陽性神經(jīng)元的化學(xué)神經(jīng)解剖學(xué)特征。
　　為了構(gòu)建攜帶人類L517W突變、D327G突變和野生型TGM6基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，首先構(gòu)建了pCAGGS-TGM6wt-Myc-GFP、pCAGGS-TGM6L517W-Myc-GFP和pCAGGS-TGM6D327G-Myc

4、-GFP三個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體。轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體上帶了Myc和GFP兩個(gè)標(biāo)簽。這些載體在培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　在此基礎(chǔ)上，我們制備了以上表達(dá)人TGM6的三種轉(zhuǎn)基因小鼠:即L517W突變、D327G突變和野生型TGM6。以上小鼠通過PCR和測(cè)序驗(yàn)證。應(yīng)用Western Blot檢測(cè)GFP和Myc，在蛋白水平證實(shí)了轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。通過TG6和GFP（或Myc）免疫雙重染色，在細(xì)胞水平顯示轉(zhuǎn)基因TG6確實(shí)表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。轉(zhuǎn)基因小鼠的成