超聲微泡復(fù)合載體的制備及其效率研究-SonoVue與脂質(zhì)體的耦聯(lián).pdf

1、背景與目的：超聲造影劑是一種微氣泡的混懸液,它在臨床上的應(yīng)用明顯提高了超聲診斷的敏感性和特異性。近年來,超聲造影劑的研究發(fā)展非常迅速,是當(dāng)前超聲醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。分子影像學(xué)的發(fā)展,使超聲造影劑在靶向分子成像和靶向治療方面顯示出了很大的發(fā)展和應(yīng)用潛力?；蜣D(zhuǎn)移技術(shù)是疾病基因治療的關(guān)鍵步驟,但是該技術(shù)在安全性、轉(zhuǎn)移效率、靶向性等問題上一直未能有突破性進展。病毒載體雖然轉(zhuǎn)移效率較高,但是其安全性問題不容忽視,相關(guān)報道發(fā)現(xiàn)病毒載體具有免疫

2、源性和對宿主細(xì)胞基因的整合可能性;非病毒載體,具有安全、簡單等優(yōu)點,但是基因轉(zhuǎn)移效率低,難以取得滿意效果。脂質(zhì)體和超聲微泡是常用的非病毒基因轉(zhuǎn)移載體之一,實驗證明,超聲輻照的方法可提高脂質(zhì)體和微泡的基因轉(zhuǎn)移效率,但是其效率和方式尚有待于進一步優(yōu)化。第二代超聲造影劑,內(nèi)充以高分子量、低溶解度的氟烷氣體,使微泡在血液中穩(wěn)定時間較長,其粒徑僅數(shù)微米,經(jīng)外周靜脈注射后可自由通過組織器官的微循環(huán),檢測微泡所產(chǎn)生的超聲信號,能得到組織血流灌注信息。

3、目前多種商品化超聲造影劑如SonoVue,已逐漸在臨床上廣泛使用。通過在造影劑表面結(jié)合特異性配體實現(xiàn)病灶靶向顯影,或利用微泡攜帶藥物或基因以介導(dǎo)其靶向治療,是第三代超聲造影劑的發(fā)展方向。理想的微泡是能夠同時具備良好的靶向顯影和靶向治療功能,以提高診療的特異性和準(zhǔn)確性。實驗證明,具有良好顯影效果的微泡其粒徑需達微米級別,但是這樣大小的微粒無法穿透毛細(xì)血管壁,難以攜帶藥物或基因進入腫瘤實質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用。為解決穿透力和顯影效果之間的矛盾,我們將

4、微米級微泡和納米級脂質(zhì)體耦聯(lián)起來,以前者實現(xiàn)靶向顯影功能,后者作為藥物或基因運輸載體,當(dāng)該復(fù)合載體經(jīng)血液循環(huán)靶向結(jié)合于靶標(biāo)并得到病灶特異聲像圖后,超聲波定向爆破微泡,便可釋放納米脂質(zhì)體進入病灶實質(zhì)。本研究擬建立商品化造影劑SonoVue和自制脂質(zhì)體耦聯(lián)的方法,并檢測微泡攜帶脂質(zhì)體的效率,為以脂質(zhì)體-微泡復(fù)合載體作為靶向造影劑及藥物載體的進一步體內(nèi)實驗甚至臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：1.觀察SonoVue微泡的一般性質(zhì),用親脂性熒

5、光染料DiI對微泡進行標(biāo)記,熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測DiI對脂質(zhì)膜微泡的標(biāo)記效果。2.檢測SonoVue微泡脂質(zhì)膜DSPE-PEG(2000)Amine的嵌入:通過流式細(xì)胞儀檢測DSPE-PEG-FITC對SonoVue微泡的標(biāo)記效率,評價兩親性分子DSPE-PEG(2000)Amine嵌入脂質(zhì)膜微泡壁的效率,并建立以這種方式對成品脂質(zhì)膜微泡進行修飾的方法,為微泡添加可連接其它活性物質(zhì)的橋梁。以生物素化SonoVue微泡的對親和素包被

6、板的靶向結(jié)合實驗,評價成品微泡可經(jīng)修飾而具有靶向性。3.脂質(zhì)體與SonoVue微泡的耦聯(lián):采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)-超聲波法制備氨基化熒光脂質(zhì)體,并用激光粒度儀測定脂質(zhì)體粒徑。二步法戊二醛交聯(lián)脂質(zhì)體和微泡,漂浮法洗滌后得到脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物。4.流式細(xì)胞儀檢測脂質(zhì)體濃度對復(fù)合載體脂質(zhì)體攜帶率的影響:每200μL的SonoVue微泡混懸液內(nèi)加入150μL的DSPE-PEG(2000)Amine(100μM),并以DSPE-PEG-FITC對微泡進行熒

7、光標(biāo)記,成為氨基化的熒光微泡;分別以0μL~300μL的濃度梯度加入戊二醛-脂質(zhì)體(DiI標(biāo)記)。流式細(xì)胞儀檢測微泡的FITC和DiI雙熒光陽性率,繪制并分析曲線圖。5.多功能酶標(biāo)儀檢測DSPE-PEG(2000)Amine濃度對復(fù)合載體脂質(zhì)體攜帶率的影響:每200μL的SonoVue微泡混懸液內(nèi)加入0～250μL的DSPE-PEG(2000)Amine溶液(100μM),加入200μL戊二醛-脂質(zhì)體(DiI標(biāo)記),構(gòu)建含不同量DSPE

8、-PEG(2000)Amine的脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物,多功能酶標(biāo)儀檢測各組微泡熒光強度,并以脂質(zhì)體熒光強度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組微泡的脂質(zhì)體攜帶率。6.檢測超聲造影模式下的微泡時間-強度變化,以評價脂質(zhì)體與微泡的耦聯(lián)、微泡的氨基化對微泡顯影功能的影響。7.脂質(zhì)體-微泡復(fù)合載體對體外培養(yǎng)細(xì)胞的作用:使MCF-7和SMMC-7721細(xì)胞與脂質(zhì)體-微泡復(fù)合載體接觸并經(jīng)超聲輻照,觀察熒光脂質(zhì)體進入細(xì)胞的情況,并與單脂質(zhì)體和單微泡組細(xì)胞比較。
　　

9、結(jié)果：1.SonoVue微泡的一般形態(tài)顯示良好。親脂性熒光染料DiI成功對SonoVue微泡標(biāo)記,標(biāo)記濃度5μM時微泡熒光陽性率為(92.31±3.62)％。2.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示當(dāng)DSPE-PEG-FITC(100μM)的濃度為20μL/mL時,微泡熒光陽性率達(94.7±6.4)%,為最佳濃度。生物素化微泡的親和素靶向性實驗顯示洗滌后生物素化微泡保留在親和素包被板上的數(shù)目明顯多于未生物素化微泡。3.旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)-超聲波法成功制備熒光

10、脂質(zhì)體,平均粒徑為272.6nm;并以戊二醛交聯(lián)法成功耦聯(lián)脂質(zhì)體和微泡。4.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示每200μL的SonoVue微泡混懸液內(nèi)加入200μL脂質(zhì)體,熒光陽性率達峰值(87.80±5.91)%。5.多功能酶標(biāo)儀檢測結(jié)果顯示每200μL的SonoVue微泡混懸液內(nèi)加入150μL的DSPE-PEG(2000)Amine,脂質(zhì)體攜帶率達(83.41±2.21)%,提高DSPE-PEG(2000)Amine的量,并不能提高脂質(zhì)體攜帶率

11、。6.超聲造影模式下微泡的時間-強度變化顯示,氨基化微泡與原始微泡聲強下降速度之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但是脂質(zhì)體的耦聯(lián)使其聲強下降速度增快,與原始微泡比較,兩者之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。7.與單脂質(zhì)體和單微泡組細(xì)胞比較,MCF-7和SMMC-7721細(xì)胞與脂質(zhì)體-微泡復(fù)合載體接觸并經(jīng)超聲輻照后,細(xì)胞內(nèi)熒光信號明顯增多。
　　結(jié)論：商品化造影劑SonoVue微泡可通過嵌入DSPE-PEG(2000)A

12、mine分子實現(xiàn)氨基化,脂質(zhì)體作為藥物或基因的運輸體,在脂質(zhì)體膜成分中加入具有活性氨基的磷脂,可以戊二醛交聯(lián)法實現(xiàn)氨基化微泡和脂質(zhì)體的耦聯(lián)。而且我們可通過改變修飾微泡及脂質(zhì)體的活性基團,選擇能獲得更高的耦聯(lián)效率及更簡便的制備方法。利用靶向微泡作為顯影手段及靶向載體時,往往需要在構(gòu)建微泡的過程中根據(jù)不同的疾病添加靶向分子及藥物,如此就要制備多種微泡。本實驗結(jié)果顯示只需制備一種微泡,在微泡成品后添加不同的靶向分子及含不同藥物、基因的脂質(zhì)體,