牛輪狀病毒HQ09株的分離與鑒定.pdf

1、牛輪狀病毒(Bovine Rotavirus，BRV)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)，輪狀病毒屬(Rotavirus)，是引起犢牛病毒性腹瀉的主要病原之一。
　　 本課題將從2009年黑龍江省齊齊哈爾市某養(yǎng)殖場(chǎng)獲得一份犢牛腹瀉糞便，進(jìn)行濾菌處理后，于MA104細(xì)胞中連續(xù)傳代，傳至第15代時(shí)測(cè)得為104.384TCID50/100μl；使用電鏡觀察病毒粒子形態(tài)，可以看到直徑大小約70nm，呈典型車輪狀的病毒粒子；通過核酸

2、類型實(shí)驗(yàn)、脂溶劑敏感性實(shí)驗(yàn)，證實(shí)該病毒為無囊膜的RNA病毒；該病毒耐酸，經(jīng)50℃水浴30min處理，感染能力下降明顯；通過病毒中和實(shí)驗(yàn)，將病毒液與牛輪狀病毒參考株陽性血清發(fā)生中和反應(yīng)，中和抗體效價(jià)達(dá)1:145。根據(jù)以上初步鑒定結(jié)果推測(cè)該分離到的病毒為牛輪狀病毒，并命名為HQ09株。
　　 根據(jù)GenBank中牛輪狀病毒NCDV株的序列設(shè)計(jì)引物，通過RT-PCR擴(kuò)增了BRV HQ09株的VP5、VP6、VP7、VP8基因。將這四段

3、基因克隆到pMD18-T載體上，進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析：結(jié)果表明HQ09 VP6基因的CDS區(qū)長(zhǎng)度是1194bp，編碼一個(gè)長(zhǎng)度為398個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)分離株HQ09與標(biāo)準(zhǔn)株NCDV、北美B223處在一個(gè)分支，核苷酸同源性分別為99.6％、87.8%，我們得出BRV HQ09屬于A群輪狀病毒；分離株HQ09 VP4基因的CDS區(qū)長(zhǎng)度是2331bp，編碼一個(gè)長(zhǎng)度為777個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)HQ0

4、9與P[1]型的標(biāo)準(zhǔn)株NCDV、北美株O Agent、日本株A5、中國(guó)山東分離株CHLY處在一個(gè)分支，核苷酸同源性分別為99.9%、97.2%、80.9%、99.6%，表明HQ09為P[1]型；HQ09 VP7基因的CDS區(qū)長(zhǎng)度是981bp，編碼一個(gè)長(zhǎng)度為327個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹分析表明HQ09與G6型的標(biāo)準(zhǔn)株NCDV、北美疫苗株WC3、阿根廷株1730、中國(guó)山東分離株CHLY處在一個(gè)分支。核苷酸同源性分別為98.9%、9

5、7.4%、98.7%、99.6%，上述結(jié)果表明BRV HQ09為G6型。
　　 以0.2 mL/只的劑量用BRV HQ09株對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃攻毒，感染小鼠出現(xiàn)腹瀉，腹瀉潛伏期為1～2天，在3～4天腹瀉現(xiàn)象較為明顯，5～6天時(shí)腹瀉現(xiàn)象消失；其臨床癥狀表現(xiàn)包括皮毛光澤差，嗜睡，攻擊性強(qiáng)，排淺黃色稀軟性糞便等；剖檢變化為各段腸道均有不同程度的臌氣，腸壁變得菲薄，腸內(nèi)充滿黃色稀薄的黏液樣或水樣內(nèi)容物；小腸病理組織學(xué)變化明顯，腸腺和腸絨毛上