幽門螺桿菌cag致病島內(nèi)cag1基因功能的研究.pdf

1、幽門螺桿菌（Helicobacterpylori,H.pylori）為人類胃部疾病的重要致病菌之一，世界范圍內(nèi)感染率達到50％。已證實，H.pylori感染與多種胃腸道疾病的發(fā)生密切相關(guān)，例如慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃粘膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤。Ⅰ型H.pylori菌株因攜帶cag致病島(cagpathogenicityisland，cagPAI)而致其毒性較強。致病島編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)能夠合成并轉(zhuǎn)運H.pylori重要的

2、毒力因子-細胞毒素相關(guān)基因A蛋白(Cytotoxin-associatedgeneA，CagA)進入到宿主細胞內(nèi)導(dǎo)致細胞功能紊亂。本文選擇了該組基因中的第一號基因cag1作為研究對象，通過微生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和生物信息學(xué)等技術(shù)探討cag1基因的功能，為深入研究cag致病島的功能和致病機制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.根據(jù)已報道的H.pylori26695全基因序列，利用PrimerPremier6.0設(shè)計c

3、ag1全長基因引物，用PCR方法從H.pylori11637基因組DNA中擴增目的基因片段，T-A克隆后構(gòu)建pMD18-T-cag1載體，完成測序工作;使用生物信息學(xué)軟件:DNAStar、ProtParam、ANTHEPROT5.0和SignalP4.1server對其基本的理化性質(zhì)和信號肽進行預(yù)測分析，同時使用Tmpred、TMHMMv2.0和SOSUI對該蛋白的跨膜區(qū)域進行預(yù)測。
　　 2.使用PrimerPremier6.

4、0設(shè)計去信號肽后的cag1基因引物，并構(gòu)建原核表達載體pET-32a-cag1，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達工程菌Rosetta(DE3);經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，確定蛋白是否可溶，大量誘導(dǎo)蛋白后，使用QIAGEN系統(tǒng)Ni2+-NTA柱純化目的蛋白。SDS-PAGE電泳、Westernblot分析和質(zhì)譜方法鑒定目的蛋白。
　　 3.純化后的Cag1融合蛋白免疫家兔，制得兔抗Cag1多克隆抗血清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmu

5、nosorbentassay,ELISA)測定抗體效價。
　　 4.利用同源重組原理，設(shè)計PCR引物并擴增cag1基因上下游同源臂片段，構(gòu)建cag1基因缺陷自殺質(zhì)粒pBlueKM40-Δcag1::kan，電轉(zhuǎn)化進入H.pyloriNCTC11637中，通過抗性篩選出陽性克隆，并使用PCR方法驗證后，即獲得cag1基因缺陷株。
　　 5.將H.pyloriNCTC11637細菌菌體收集并裂解菌體，使用超高速低溫離心機對H

6、.pylori進行亞細胞分離，分為膜組分（包括內(nèi)膜和外膜）、胞質(zhì)組分和周質(zhì)組分，包括周質(zhì)間隙蛋白、胞質(zhì)蛋白及膜蛋白，使用Westernblot方法，以兔抗Cag1多克隆抗體為一抗，檢測Cag1蛋白亞細胞定位。
　　 6.將cag1基因缺陷株與NCTC11637野生株分別與胃上皮細胞GES-1共培養(yǎng)后，檢測CagA蛋白轉(zhuǎn)運量，研究cag1基因缺陷對CagA蛋白轉(zhuǎn)運的影響。
　　 7.收集cag1基因缺陷株與NCTC1163

7、7野生株，裂解后得到細菌全菌蛋白，分別使用Westernblot方法檢測cag致病島重要編碼蛋白CagX、CagM、CagL和CagI的表達量，研究cag1基因?qū)@些蛋白合成與穩(wěn)定的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.H.pyloriNCTC11637菌株cag1基因全長為348bp，編碼蛋白長度為115aa，其相對分子質(zhì)量為12.42kDa，等電點為8.58。該蛋白屬于穩(wěn)定且親水性的蛋白。在蛋白兩端存在多個親水區(qū)域，而蛋白

8、的中段則是疏水的跨膜區(qū)域。預(yù)測該蛋白存在信號肽，位置在N端的前21個堿基，在21至22的位置處斷裂。并且存在一個跨膜區(qū)域，位于蛋白中段，兩端親水，極可能游離于膜外。
　　 2.成功構(gòu)建原核表達載體pET-32a-cag1，在大腸桿菌中異源表達，獲得大量目的蛋白Cag1。并通過QIAGEN系統(tǒng)純化目的蛋白，利用質(zhì)譜技術(shù)對蛋白進行鑒定。將純化后的蛋白免疫家兔制備了兔抗Cag1多克隆抗體，效價為1∶3.2×105。
　　 3.

9、成功構(gòu)建cag1基因敲除重組自殺質(zhì)粒:pBlueKM40-Δcag1::kan。電轉(zhuǎn)化自殺質(zhì)粒進入H.pyloriNCTC11637菌體內(nèi)，通過卡那霉素抗性篩選出同源重組成功的菌株，即為H.pyloricag1基因缺陷株:Δcag1。并用PCR方法以及對PCR產(chǎn)物進行測序的方法驗證。
　　 4.以兔抗Cag1多克隆抗體為一抗作Westernblot分析，確定Cag1位于菌體膜部分;H.pylori與GES-1細胞共培養(yǎng)，檢測Ca

10、gA蛋白轉(zhuǎn)運量，結(jié)果顯示cag1基因缺陷株CagA轉(zhuǎn)運量比野生株少，但仍具有轉(zhuǎn)運CagA的能力;比較H.pylori野生株和cag1基因缺陷株中四種已知Cag-T4SS重要的結(jié)構(gòu)蛋白的表達量。結(jié)果顯示CagX、CagM、CagL和CagI蛋白表達水平?jīng)]有明顯差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功克隆了cag1全長基因，使用生物信息學(xué)方法了解其編碼蛋白的理化性質(zhì)，并預(yù)測了其存在的信號肽和跨膜區(qū)域。
　　 2.成功構(gòu)建

11、了cag1基因原核表達載體pET-32a-cag1，通過IPTG誘導(dǎo)獲得和純化了大量目的蛋白，免疫家兔后，制備了兔抗Cag1蛋白的多克隆抗體。
　　 3.成功構(gòu)建了自殺質(zhì)粒pBlueKM40-Δcag1::kan，并且獲得了一株cag1基因缺陷株Δcag1。
　　 4.確定了Cag1蛋白的亞細胞定位，位于菌體膜部位;證明了cag1基因缺失并沒有使H.pylori喪失CagA蛋白轉(zhuǎn)運的能力，但其轉(zhuǎn)運量明顯減少;證明了cag