銀杏葉提取物及其萜類單體對細胞色素P450酶的影響及誘導機制的研究.pdf

1、銀杏樹是銀杏科銀杏屬唯一生存的老樹種之一，其葉和果有重要的藥用價值，在我國銀杏作為藥用已有五千多年的歷史?，F代醫(yī)學證明：銀杏葉含有多種藥用成分，是制作“三抗”(抗血栓、衰老、癌變)、“兩防”(防心腦血管疾病、老年癡呆)、“兩提高”(提高智商、免疫力)的新藥主料。其制劑不僅被廣泛用于心腦血管疾病、神經及精神性疾病等方面的治療，而且在老年性疾病的治療方面也取得一定成效，已成為其國內外的暢銷藥品，更有許多國家已將其作為保健品、保健品中的添加物

2、甚至食品添加劑長期使用。 本課題組已經報道：大鼠連續(xù)10天灌胃給藥GBE 100mg/kg可顯著誘導大鼠肝藥酶CYP3A1、CYP1A2和CYP2B的酶活性、基因表達和蛋白表達，并可導致大鼠口服普萘洛爾后體內代謝的增加。但是由于種屬差異的原因，不能直接推導到人，因此需要進一步的研究GBE對人CYP450酶的影響及誘導機制。 GBE有兩大有效成分：黃酮類化合物和萜內酯類化合物。本課題組已系統(tǒng)研究主要黃酮類化合物(槲皮素和山

3、萘酚)對大鼠體內P450的影響，發(fā)現槲皮素和山萘酚僅能誘導大鼠體內CYP1A2，而對CYP3A1、CYP281/2、CYP2C11、CYP2C7、CYP2E1和CYP2D2沒有影響。萜內酯類化合物是銀杏中特有的化合物，迄今尚未發(fā)現存在于其他任何植物中，目前沒有系統(tǒng)研究萜內酯單體對CYP4.50酶影響的報道。因此本研究的主要目的是：從酶活性、基因表達和蛋白表達三個方面研究GBE對人、大鼠原代肝細胞中CYP3A的影響，比較種屬差異；系統(tǒng)研究

4、GBE的三個主要萜類單體白果內酯(BB)、銀杏內酯A(GA)和銀杏內酯B(GB)對大鼠體內CYP450酶的影響，分析其在GBE誘導作用中的地位；進一步研究誘導CYP3A的機制。 一、人、大鼠原代肝細胞模型的建立和驗證目的：建立人和大鼠原代肝細胞培養(yǎng)模型，為下一步藥物誘導實驗提供一定數量的正常細胞。 方法：采取簡單易行而且經濟的方法，對經典“二步”灌流法和膠原鋪被方法的改進后，成功地建立了人和大鼠原代肝細胞培養(yǎng)模型。胎盼藍

5、染色后觀察存活率，記錄細胞數量。RT-PCR檢測人原代肝細胞貼壁后連續(xù)六天CYP3A4 mRNA的表達。利用經典的陽性誘導劑利福平(RIF，5O μM)在貼壁第四天后，分別與人原代肝細胞共同孵育24、48和72小時后，RT-PCR檢測CYP3A4 mRNA的表達，確定進行藥物誘導實驗時間。 結論：采取了簡單易行而且經濟的方法，成功建立人和大鼠原代肝細胞模型，可為下一步的實驗提供一定數量的正常細胞，選擇在原代肝細胞貼壁培養(yǎng)72小時

6、后，給予藥物，并共同孵育72小時，進行藥物誘導實驗。 二、銀杏葉提取物(GBE)、白果內酯(BB)和銀杏內酯B(GB)對人和大鼠原代肝細胞中CYP3A的影響研究目的：研究GBE、BB和GB對人和大鼠原代肝細胞中CYP3A的影響，并比較種屬差異。 方法：在人和大鼠原代肝細胞貼壁72小時后，GBE(100、500和2500 ng/mL)、BB(2、10和50 ng/mL)和GB(2、10和50 ng/mL)分別與細胞共同孵育

7、72小時。LC/MS/MS檢測酶活性，RT-PCR檢測基因表達，Western-blotting檢測蛋白表達。 結論：GBE能誘導人和大鼠原代肝細胞中CYP3A，人和大鼠不存在種屬差異。BB能誘導人和大鼠原代肝細胞中CYP3A蛋白表達，GB對其沒有影響。提示BB很可能在GBE誘導CYP3A作用占重要地位，但需要體內實驗進一步證實。 三、白果內酯、銀杏內酯B和銀杏內酯A(GA)對大鼠體內CYP450酶的影響研究目的：系統(tǒng)研

8、究三個主要萜類單體(BB、GB和GA)對大鼠體內CYP450酶(CYP3A1、CYP1A2、CYP2E1、CYP281/2、CYP2C7、CYP2C11和CYP2D2)的影響。 方法：100 mg/kg劑量的GBE，0.3、1.5、3、10和30 mg/kg劑量的BB，1.5、10和30 mg/kg劑量的GA，1.5、10和30 mg/kg劑量的GB，連續(xù)灌胃給予SD雄性大鼠10天，地塞米松(DEX)100 mg/kg連續(xù)腹腔注

9、射4天，β-萘黃酮(β-NF)80 mg/kg連續(xù)腹腔注射3天，20％7,醇水溶液5 mL/kg連續(xù)灌胃4天，苯巴比妥(PB)80 mg/kg連續(xù)腹腔注射3天。LC/MS/MS“Cocktail”法檢測酶活性，RT-PCR檢測基因表達，Western-blotting檢測蛋白表達。 結論：BB能顯著誘導大鼠體內CYP3A1、CYPlA2和CYP281/2，是使GBE產生肝藥酶誘導作用(尤其是對CYP3A和CYP281/2)的主要

10、成分；GA和GB僅誘導大鼠體內CYP1A2，對CYP3A1和CYP281/2沒有影響；三個單體對CYP2C7、CYP2C11和CYP2D2均沒有影響。闡明了BB是GBE誘導CYP450酶的主要成分，為單體新藥開發(fā)提供參考信息和依據。 四、銀杏葉提取物和白果內酯對CYP3A誘導機制的研究從四個方面研究GBE和BB對CYP3A的誘導機制。 一)、目的：研究GBE、BB、GA和GB是否能通過孕烷X受體(PXR)的活化而誘導CY

11、P3A4轉錄。 方法：GBE(100 ng/mL、500 ng/mL、5 μg/mL和25 μg/mL)、BB(10 ng/mL、100ng/mL、1μg/mL和10 μg/mL)、GB(10 ng/mL、100 ng/mL、1 μg/mL和10 μg/mL)和GA(10 ng/mL、100 ng/mL、1μg/mL和10μg/mL)，與轉染了600 ng/孔pTK-(3A4)3-Luc報告基因質粒和100 ng/孔pCMX-h

12、PXR表達質粒的CV-1細胞共同孵育24小時，測定細胞中熒光素酶。結果：GBE(100 ng/mL、500 ng/mL、5 μg/mL和25 μg/mL)分別活化PXR 1.55、1.76、1.8和2.21倍，BB(10 ng/mL、100 ng/mL、1μg/mL和10μg/mL)分別活化PXR 1.77、1.85、2.1和0.97倍，GA和GB不能活化PXR。 二)、目的：基于NFκ-B p65能與PXR競爭性結合RXRα的

13、現象來研究GBE和BB對大鼠原代肝細胞中RXRα和NFκ-B p65的蛋白表達的影響。 方法：GBE(1和10 μg/mL)和BB(1μg/mL)分別與大鼠原代肝細胞共同孵育72小時后，Western-blotting檢測細胞中RXRα和NFκ-B p65的蛋白表達。 三)、目的：研究GBE和BB對CYP3A抑制劑脂多糖(LPS)的拮抗作用。 方法：DEX(10 μM)、GBE(100、500和2500 ng/m

14、L)和BB(3、15和75 ng/mL)分別與空白培養(yǎng)基、LPS(5μg/mL)、LPS(5 μg/mL)+DEX(10μM)共同孵育72小時后，Western-blotting檢測其大鼠原代肝細胞中CYP3A1的蛋白表達。 四)、目的：進一步研究GBE抑制NF-κB的機制。 方法：GBE(350 ng/mL、700 ng/mL、3.5μg/mL和7μg/mL)預處理26小時后與TNFα共同孵育后，Western-blo

15、tting檢測IκBα蛋白表達的變化；GBE 5μg/mL預處理后，轉染了pNF-κB-Luc的Hela細胞中熒光素酶的活性。 結果：與未預處理組相比，經TNFα處理Hela細胞30min后，IκBα被磷酸化，并且由于降解其含量明顯減少，然而經不同濃度銀杏葉提取物預處理的Hela細胞和未處理組相比較，經TNFα再處理細胞30min后，IκBα減少未見明顯差異；TNFα刺激組熒光素酶活性高于空白組4-5倍，而經銀杏葉提取物預處理后

16、熒光素酶的活性顯著降低。結論：通過以上研究表明：1)GBE和BB能通過PXR的活化而誘導CYP3A4轉錄；GA和GB不能活化PXR，對CYP3A4轉錄無誘導作用；2)GBE和BB均不能通過增加RXRα蛋白表達或減少NFκ-Bp65蛋白表達來影響PXR通路，從而產生誘導CYP3A的作用；3)GBE和BB不僅可以拮抗LPS對CYP3A1蛋白表達抑制作用，而且對LPS降低DEX誘導CYP3A1蛋白表達產生拮抗，其中BB的拮抗能力弱于GBE，提

17、示GBE和BB可能抑制NF-κB增強PXR活性；4)GBE不能抑制TNFa誘導的IκBα的磷酸化和降解，但對TNFα誘導的NF-κB基因轉錄活性有抑制作用。 本研究證實了GBE能顯著誘導人原代肝細胞中CYP3A4；系統(tǒng)闡述了BB、GA和GB對大鼠體內CYP450的影響，其中BB是GBE誘導CYP3A1、CYP281/2和CYP1A2的主要成分，GA和GB為GBE誘導CYP1A2貢獻了力量；GBE租BB能通過對PXR5通路的激活和