版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、銀杏樹是銀杏科銀杏屬唯一生存的老樹種之一,其葉和果有重要的藥用價值,在我國銀杏作為藥用已有五千多年的歷史?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明:銀杏葉含有多種藥用成分,是制作“三抗”(抗血栓、衰老、癌變)、“兩防”(防心腦血管疾病、老年癡呆)、“兩提高”(提高智商、免疫力)的新藥主料。其制劑不僅被廣泛用于心腦血管疾病、神經(jīng)及精神性疾病等方面的治療,而且在老年性疾病的治療方面也取得一定成效,已成為其國內(nèi)外的暢銷藥品,更有許多國家已將其作為保健品、保健品中的添加物
2、甚至食品添加劑長期使用。 本課題組已經(jīng)報道:大鼠連續(xù)10天灌胃給藥GBE 100mg/kg可顯著誘導(dǎo)大鼠肝藥酶CYP3A1、CYP1A2和CYP2B的酶活性、基因表達(dá)和蛋白表達(dá),并可導(dǎo)致大鼠口服普萘洛爾后體內(nèi)代謝的增加。但是由于種屬差異的原因,不能直接推導(dǎo)到人,因此需要進(jìn)一步的研究GBE對人CYP450酶的影響及誘導(dǎo)機(jī)制。 GBE有兩大有效成分:黃酮類化合物和萜內(nèi)酯類化合物。本課題組已系統(tǒng)研究主要黃酮類化合物(槲皮素和山
3、萘酚)對大鼠體內(nèi)P450的影響,發(fā)現(xiàn)槲皮素和山萘酚僅能誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)CYP1A2,而對CYP3A1、CYP281/2、CYP2C11、CYP2C7、CYP2E1和CYP2D2沒有影響。萜內(nèi)酯類化合物是銀杏中特有的化合物,迄今尚未發(fā)現(xiàn)存在于其他任何植物中,目前沒有系統(tǒng)研究萜內(nèi)酯單體對CYP4.50酶影響的報道。因此本研究的主要目的是:從酶活性、基因表達(dá)和蛋白表達(dá)三個方面研究GBE對人、大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A的影響,比較種屬差異;系統(tǒng)研究
4、GBE的三個主要萜類單體白果內(nèi)酯(BB)、銀杏內(nèi)酯A(GA)和銀杏內(nèi)酯B(GB)對大鼠體內(nèi)CYP450酶的影響,分析其在GBE誘導(dǎo)作用中的地位;進(jìn)一步研究誘導(dǎo)CYP3A的機(jī)制。 一、人、大鼠原代肝細(xì)胞模型的建立和驗(yàn)證目的:建立人和大鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)模型,為下一步藥物誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)提供一定數(shù)量的正常細(xì)胞。 方法:采取簡單易行而且經(jīng)濟(jì)的方法,對經(jīng)典“二步”灌流法和膠原鋪被方法的改進(jìn)后,成功地建立了人和大鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)模型。胎盼藍(lán)
5、染色后觀察存活率,記錄細(xì)胞數(shù)量。RT-PCR檢測人原代肝細(xì)胞貼壁后連續(xù)六天CYP3A4 mRNA的表達(dá)。利用經(jīng)典的陽性誘導(dǎo)劑利福平(RIF,5O μM)在貼壁第四天后,分別與人原代肝細(xì)胞共同孵育24、48和72小時后,RT-PCR檢測CYP3A4 mRNA的表達(dá),確定進(jìn)行藥物誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)時間。 結(jié)論:采取了簡單易行而且經(jīng)濟(jì)的方法,成功建立人和大鼠原代肝細(xì)胞模型,可為下一步的實(shí)驗(yàn)提供一定數(shù)量的正常細(xì)胞,選擇在原代肝細(xì)胞貼壁培養(yǎng)72小時
6、后,給予藥物,并共同孵育72小時,進(jìn)行藥物誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。 二、銀杏葉提取物(GBE)、白果內(nèi)酯(BB)和銀杏內(nèi)酯B(GB)對人和大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A的影響研究目的:研究GBE、BB和GB對人和大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A的影響,并比較種屬差異。 方法:在人和大鼠原代肝細(xì)胞貼壁72小時后,GBE(100、500和2500 ng/mL)、BB(2、10和50 ng/mL)和GB(2、10和50 ng/mL)分別與細(xì)胞共同孵育
7、72小時。LC/MS/MS檢測酶活性,RT-PCR檢測基因表達(dá),Western-blotting檢測蛋白表達(dá)。 結(jié)論:GBE能誘導(dǎo)人和大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A,人和大鼠不存在種屬差異。BB能誘導(dǎo)人和大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A蛋白表達(dá),GB對其沒有影響。提示BB很可能在GBE誘導(dǎo)CYP3A作用占重要地位,但需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。 三、白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯B和銀杏內(nèi)酯A(GA)對大鼠體內(nèi)CYP450酶的影響研究目的:系統(tǒng)研
8、究三個主要萜類單體(BB、GB和GA)對大鼠體內(nèi)CYP450酶(CYP3A1、CYP1A2、CYP2E1、CYP281/2、CYP2C7、CYP2C11和CYP2D2)的影響。 方法:100 mg/kg劑量的GBE,0.3、1.5、3、10和30 mg/kg劑量的BB,1.5、10和30 mg/kg劑量的GA,1.5、10和30 mg/kg劑量的GB,連續(xù)灌胃給予SD雄性大鼠10天,地塞米松(DEX)100 mg/kg連續(xù)腹腔注
9、射4天,β-萘黃酮(β-NF)80 mg/kg連續(xù)腹腔注射3天,20%7,醇水溶液5 mL/kg連續(xù)灌胃4天,苯巴比妥(PB)80 mg/kg連續(xù)腹腔注射3天。LC/MS/MS“Cocktail”法檢測酶活性,RT-PCR檢測基因表達(dá),Western-blotting檢測蛋白表達(dá)。 結(jié)論:BB能顯著誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)CYP3A1、CYPlA2和CYP281/2,是使GBE產(chǎn)生肝藥酶誘導(dǎo)作用(尤其是對CYP3A和CYP281/2)的主要
10、成分;GA和GB僅誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)CYP1A2,對CYP3A1和CYP281/2沒有影響;三個單體對CYP2C7、CYP2C11和CYP2D2均沒有影響。闡明了BB是GBE誘導(dǎo)CYP450酶的主要成分,為單體新藥開發(fā)提供參考信息和依據(jù)。 四、銀杏葉提取物和白果內(nèi)酯對CYP3A誘導(dǎo)機(jī)制的研究從四個方面研究GBE和BB對CYP3A的誘導(dǎo)機(jī)制。 一)、目的:研究GBE、BB、GA和GB是否能通過孕烷X受體(PXR)的活化而誘導(dǎo)CY
11、P3A4轉(zhuǎn)錄。 方法:GBE(100 ng/mL、500 ng/mL、5 μg/mL和25 μg/mL)、BB(10 ng/mL、100ng/mL、1μg/mL和10 μg/mL)、GB(10 ng/mL、100 ng/mL、1 μg/mL和10 μg/mL)和GA(10 ng/mL、100 ng/mL、1μg/mL和10μg/mL),與轉(zhuǎn)染了600 ng/孔pTK-(3A4)3-Luc報告基因質(zhì)粒和100 ng/孔pCMX-h
12、PXR表達(dá)質(zhì)粒的CV-1細(xì)胞共同孵育24小時,測定細(xì)胞中熒光素酶。結(jié)果:GBE(100 ng/mL、500 ng/mL、5 μg/mL和25 μg/mL)分別活化PXR 1.55、1.76、1.8和2.21倍,BB(10 ng/mL、100 ng/mL、1μg/mL和10μg/mL)分別活化PXR 1.77、1.85、2.1和0.97倍,GA和GB不能活化PXR。 二)、目的:基于NFκ-B p65能與PXR競爭性結(jié)合RXRα的
13、現(xiàn)象來研究GBE和BB對大鼠原代肝細(xì)胞中RXRα和NFκ-B p65的蛋白表達(dá)的影響。 方法:GBE(1和10 μg/mL)和BB(1μg/mL)分別與大鼠原代肝細(xì)胞共同孵育72小時后,Western-blotting檢測細(xì)胞中RXRα和NFκ-B p65的蛋白表達(dá)。 三)、目的:研究GBE和BB對CYP3A抑制劑脂多糖(LPS)的拮抗作用。 方法:DEX(10 μM)、GBE(100、500和2500 ng/m
14、L)和BB(3、15和75 ng/mL)分別與空白培養(yǎng)基、LPS(5μg/mL)、LPS(5 μg/mL)+DEX(10μM)共同孵育72小時后,Western-blotting檢測其大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A1的蛋白表達(dá)。 四)、目的:進(jìn)一步研究GBE抑制NF-κB的機(jī)制。 方法:GBE(350 ng/mL、700 ng/mL、3.5μg/mL和7μg/mL)預(yù)處理26小時后與TNFα共同孵育后,Western-blo
15、tting檢測IκBα蛋白表達(dá)的變化;GBE 5μg/mL預(yù)處理后,轉(zhuǎn)染了pNF-κB-Luc的Hela細(xì)胞中熒光素酶的活性。 結(jié)果:與未預(yù)處理組相比,經(jīng)TNFα處理Hela細(xì)胞30min后,IκBα被磷酸化,并且由于降解其含量明顯減少,然而經(jīng)不同濃度銀杏葉提取物預(yù)處理的Hela細(xì)胞和未處理組相比較,經(jīng)TNFα再處理細(xì)胞30min后,IκBα減少未見明顯差異;TNFα刺激組熒光素酶活性高于空白組4-5倍,而經(jīng)銀杏葉提取物預(yù)處理后
16、熒光素酶的活性顯著降低。結(jié)論:通過以上研究表明:1)GBE和BB能通過PXR的活化而誘導(dǎo)CYP3A4轉(zhuǎn)錄;GA和GB不能活化PXR,對CYP3A4轉(zhuǎn)錄無誘導(dǎo)作用;2)GBE和BB均不能通過增加RXRα蛋白表達(dá)或減少NFκ-Bp65蛋白表達(dá)來影響PXR通路,從而產(chǎn)生誘導(dǎo)CYP3A的作用;3)GBE和BB不僅可以拮抗LPS對CYP3A1蛋白表達(dá)抑制作用,而且對LPS降低DEX誘導(dǎo)CYP3A1蛋白表達(dá)產(chǎn)生拮抗,其中BB的拮抗能力弱于GBE,提
17、示GBE和BB可能抑制NF-κB增強(qiáng)PXR活性;4)GBE不能抑制TNFa誘導(dǎo)的IκBα的磷酸化和降解,但對TNFα誘導(dǎo)的NF-κB基因轉(zhuǎn)錄活性有抑制作用。 本研究證實(shí)了GBE能顯著誘導(dǎo)人原代肝細(xì)胞中CYP3A4;系統(tǒng)闡述了BB、GA和GB對大鼠體內(nèi)CYP450的影響,其中BB是GBE誘導(dǎo)CYP3A1、CYP281/2和CYP1A2的主要成分,GA和GB為GBE誘導(dǎo)CYP1A2貢獻(xiàn)了力量;GBE租BB能通過對PXR5通路的激活和
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 銀杏葉提取物對大鼠肝微粒體細(xì)胞色素P450酶活性的影響.pdf
- 銀杏葉提取物對細(xì)胞色素P450 2E1表達(dá)的抑制作用.pdf
- 銀杏葉提取物對胃腸運(yùn)動的影響及其機(jī)制研究.pdf
- 銀杏葉提取物及其有效單體防治糖尿病腎病的作用及機(jī)制.pdf
- 銀杏葉提取物檢測
- 銀杏葉提取物對大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響.pdf
- 銀杏葉提取物對肉雞免疫功能影響的研究.pdf
- 銀杏葉提取物對辛伐他汀藥物代謝影響的研究.pdf
- 藥物代謝Ⅰ相酶(細(xì)胞色素P450)的誘導(dǎo)研究.pdf
- Cocktail探針?biāo)幬锓ㄔu價紅茶和綠茶水提取物對大鼠細(xì)胞色素P450酶的影響.pdf
- 銀杏葉提取物誘導(dǎo)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡及其機(jī)制的研究.pdf
- 銀杏葉提取物對大鼠中腦原代細(xì)胞的作用.pdf
- 銀杏葉提取物對老齡大鼠心肌老化的影響.pdf
- 銀杏葉提取物對大鼠真皮成纖維細(xì)胞的影響.pdf
- 銀杏葉提取物微丸的研究.pdf
- 復(fù)方銀杏葉提取物滴丸的研究.pdf
- 青藤堿對細(xì)胞色素P450的影響及其代謝機(jī)制研究.pdf
- 銀杏葉提取物對VD小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及其機(jī)理的研究.pdf
- 銀杏葉提取物對糖尿病大鼠巨噬細(xì)胞及腎臟的影響.pdf
- 銀杏葉提取物對肝硬化門脈高壓大鼠的影響及機(jī)制探討.pdf
評論
0/150
提交評論