煙草表達(dá)粉塵螨Ⅰ類變應(yīng)原及其免疫治療研究.pdf

1、目的：
　　 構(gòu)建粉塵螨I類變應(yīng)原（Derf1）瞬時(shí)表達(dá)載體TRBO-Derf1，觀察其在煙草中的表達(dá)并探討煙草表達(dá)的Derf1疫苗免疫治療過敏性哮喘的療效。
　　 方法：
　　 1.重組質(zhì)粒TRBO-Derf1的構(gòu)建及在煙草葉片中的表達(dá)
　　 以粉塵螨總RNA為模板，采用RT-PCR方法擴(kuò)增Derf1基因并定向克隆到瞬時(shí)表達(dá)載體TRBO，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)

2、GV3101株后，抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切及PCR鑒定。將含TRBO-Derf1重組質(zhì)粒的GV3101注射本氏煙葉片，SDS-PAGE電泳檢測(cè)注射3、4、5、6天后Derf1的表達(dá)。
　　 2.煙草表達(dá)的粉塵螨I類變應(yīng)原對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的免疫治療研究
　　 100只BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組，分別為PBS組即陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照卵白蛋白(OVA)組，原核表達(dá)Derf1(pDerf1)組，煙草表達(dá)Derf1(tDerf1)組，

3、煙草表達(dá)蛋白免疫治療組(tDerf1-T)，PBS組用PBS，其余4組分別用OVA、pDerf1、tDerf1、tDerf1致敏激發(fā)BALB/c小鼠，于0、7、14天腹腔注射致敏，第21天霧化吸入激發(fā)，連續(xù)7天，24h后，各組小鼠引頸處死;保留tDerf1-T組繼續(xù)用tDerf1免疫治療;通過肺組織病理切片觀察小鼠肺部炎癥;收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)進(jìn)行白細(xì)胞及分類計(jì)數(shù);ELISA法檢測(cè)BALF、脾細(xì)胞培養(yǎng)上清(SCCS)的特異性

4、細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-17和IFN-γ和血清中變應(yīng)原特異性IgE、IgG1抗體濃度。
　　 結(jié)果：
　　 1.重組質(zhì)粒TRBO-Derf1的構(gòu)建及在煙草葉片中的表達(dá)
　　 電泳及測(cè)序表明Derf1基因克隆成功，大小為627bp。經(jīng)PCR及酶切反應(yīng)證實(shí)重組質(zhì)粒TRBO-Derf1成功轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌。SDS-PAGE電泳檢測(cè)表明，該蛋白于第5和6天在煙草葉片中高表達(dá)。
　　 2.煙草表達(dá)

5、的粉塵螨I類變應(yīng)原對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的免疫治療研究
　　 煙草表達(dá)蛋白免疫治療組肺部變態(tài)反應(yīng)性炎癥病理變化較模型組明顯減輕;BALF中的細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、IL-4、IL-5、IL-17、血清抗原特異性IgE抗體和脾細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-17均低于陽(yáng)性對(duì)照組;BALF和SCCS中IL-2、IFN-γ含量均高于陽(yáng)性對(duì)照組。
　　 結(jié)論：
　　 構(gòu)建的瞬時(shí)表達(dá)重組載體TRBO-Derf1成功表達(dá)于