ⅰ.菌根真菌在金線蓮栽培中應(yīng)用及其共生機(jī)理研究;ⅱ.粉塵螨和黑麥草變應(yīng)原決定簇及其全長(zhǎng)基因克隆與表達(dá)

1、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文Ⅰ.菌根真菌在金線蓮栽培中應(yīng)用及其共生機(jī)理研究;Ⅱ.粉塵螨和黑麥草變應(yīng)原決定簇及其全長(zhǎng)基因克隆與表達(dá)姓名：唐明娟申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生藥學(xué)指導(dǎo)教師：郭順星;林忠平20030501中文摘要中文摘要二、粉塵螨和黑麥草變應(yīng)原決定簇及全長(zhǎng)基因的克隆與表達(dá)粉塵螨和黑麥草花粉是兩類比較重要的變應(yīng)原，它們引發(fā)許多人的I g E 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，出現(xiàn)過(guò)敏性鼻炎、哮喘和花粉熱病等臨床交態(tài)反應(yīng)癥狀?，F(xiàn)階段對(duì)過(guò)敏反應(yīng)的治療除服

2、用抗組胺藥外，還采用變應(yīng)原進(jìn)行免疫治療。近年來(lái)許多變應(yīng)原的基因已被克隆，這對(duì)于深入了解過(guò)敏反應(yīng)機(jī)制起重要作用。標(biāo)準(zhǔn)化的重組過(guò)敏原對(duì)致敏原性的評(píng)估也十分重要。尋找變應(yīng)原決定簇可以用以指導(dǎo)變應(yīng)原的改造，以降低致敏活性，更安全更有效地用于免疫治療。我們通過(guò)P C R 途徑獲得了兩種致敏原的c D N A 克隆。它們分別編碼粉塵螨D e r f l I ( 6 7 ．9 0 a a ) ( 簡(jiǎn)化為M ) 和黑麥草l o l p 5 ( 4 9

3、．6 0 a a ) ( 簡(jiǎn)化為A ) 。將它們構(gòu)建到原核表達(dá)載體p G E X - - K G 中，在大腸桿菌B L 2 1 中得到了高效表達(dá)。采用親和層析的辦法對(duì)表達(dá)的融合蛋白G s T —M 和G S T—A 進(jìn)行純化，純度高達(dá)9 0 ％以上。用純化的蛋白與病人陽(yáng)性血清I g E 反應(yīng)，結(jié)果G s T —M 無(wú)過(guò)敏活性，G S T —A 有I g E 結(jié)合活性。利用P C R 技術(shù)從粉塵螨和黑麥草基因組中擴(kuò)增到5 6 0 b p

4、的D e r f l l 全長(zhǎng)和9 8 0 b p的l o l p 5 全長(zhǎng)，并構(gòu)建成原核表達(dá)載體p B V 2 2 0 - - D e r f l I 和p B V 2 2 0 - l o l p 5 ，在大腸桿菌中得到了表達(dá)。為了研究致敏性蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中致敏原性的變化和轉(zhuǎn)基因植物中過(guò)敏性評(píng)估方法的標(biāo)準(zhǔn)化，我們構(gòu)建了表達(dá)上述兩種致敏原的雙元表達(dá)載體p 3 3 0 1 ．B 1 1 2 1 一D e r f l l 和p 3 3 0

5、 1 ．B 1 1 2 1 - l o l p 5 ，并將其導(dǎo)入煙草中。通過(guò)R N A 干涉的技術(shù)降低過(guò)敏原的免疫原性，將黑麥草花粉過(guò)敏原的反義基因構(gòu)建到雙元表達(dá)載體p 3 3 0 1 - - B 1 1 2 1 中，以期在R N A 水平抑制花粉過(guò)敏原的表達(dá)。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下對(duì)煙草進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過(guò)G U S 染色和P C R 方法鑒定D e r f l I 的陽(yáng)性植株。結(jié)果得到2 l 株轉(zhuǎn)D e r f l I基因的陽(yáng)性植株。E L I