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文檔簡介
1、一、目的意義: 腦腫瘤嚴重危害人類健康。據(jù)統(tǒng)計,惡性腦腫瘤占人類所有癌癥患者的2%,占兒童全身腫瘤發(fā)病率的20%~25%,綜合發(fā)病年齡高峰在30~40歲,或10~20歲。其中又以膠質細胞瘤發(fā)病率最高,約占惡性腦腫瘤40.49%。膠質母細胞瘤是最常見的成人原發(fā)性惡性腦腫瘤,病人從確診開始的中間生存時間是15個月,由于膠質細胞瘤分化不全、且深入神經細胞深處,常規(guī)的抗腫瘤措施,包括手術、放療和化療都很難有效根除,導致其復發(fā)率較高。最近
2、研究發(fā)現(xiàn),在腦膠質瘤中存在一種數(shù)量極少具有干細胞的特性的細胞,正是這類細胞導致膠質瘤產生和復發(fā),這類細胞已經定義為腦腫瘤干細胞(Braintumorstemcells,BTSCs)。 BTSCs存在于惡性腦膠質瘤的事實最早由Ignatova等(2002年)報道,他們將腦膠質瘤細胞在神經干細胞(Neuralstemcells,NSCs)培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng),結果發(fā)現(xiàn)有克隆形成,其細胞表達NSCs標記物Nestin,分化細胞則同時或單
3、獨表達神經元特異性烯醇化酶(neuronespecificenolase,NSE)、神經膠質細胞纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)和神經元β-Ⅲ微管蛋白(neuronalbeta-Ⅲtubulin)等并有基因轉錄,提示這類細胞具有NSCs特性,具有為神經元和膠質細胞的能力因而,把這類細胞稱為腫瘤干細胞樣細胞(tumorstem-likecells),并認為其與腫瘤起源和生長有關。此后,又有
4、Singh等(2004年)發(fā)現(xiàn),腦腫瘤中幾乎所有的細胞增殖均由一小部分表達人類干細胞標志物CD133+的細胞即BTSCs產生。在培養(yǎng)基中,這些細胞可以增殖并分化為神經元和(或)膠質細胞,比例、表型與原腫瘤一致。這些新生的腫瘤細胞又可以在培養(yǎng)基中產生新的腫瘤細胞,證明它們是腫瘤細胞而不是被腫瘤樣本污染的正常NSCs。Hemmati等(2003年)對小兒髓母細胞瘤和膠質瘤進行研究,也發(fā)現(xiàn)存在與NSCs性質相似的細胞,它們在體外可形成神經球,
5、能夠自我更新,且具有多分化潛能,在一定環(huán)境中可分化成具有神經元和/或膠質細胞表面標志的細胞,細胞比例與原腫瘤相似,提示其參與了腦腫瘤的形成;與正常NSCs不同的是,這些細胞表現(xiàn)出異常的增殖能力,其共同特征是:(1)表達NSCs特異性標記,如Nestin、CD133等;(2)具有自我更新和增殖能力,可以成為永生細胞;(3)在異體原位移植后,可以分化為與原腫瘤相似表型和核型的腫瘤。 樹突狀細胞(dendriticcells,DCs)
6、是體內的專職抗原呈遞細胞,具有活躍地攝取、處理抗原的能力,并表達高水平的主要組織相容性復合體(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)-I、II類抗原和CD80、CD86等共刺激分子,因而能有效地向T細胞呈遞抗原、激發(fā)初次細胞免疫應答。利用DCs的這一重要功能,基于DCs的腫瘤疫苗是腫瘤免疫治療的重要途徑之一,并結合BTSCs特點,本研究以臨床膠質瘤組織為研究對象,在分別分離純化鑒定BTSCs及DCs的基礎
7、上、重點探討以BTSCs為免疫原性的DCs融合瘤苗對膠質瘤的免疫殺傷作用,探討免疫治療新方法。DCs疫苗的構建方法很多,如腫瘤細胞mRNA沖擊DCs法、腫瘤細胞抗原多肽沖擊DCs法、腫瘤細胞裂解物沖擊DCs法、抗原基因修飾DCs法等。隨著對腫瘤細胞融合特性研究的深入以及樹突狀細胞的發(fā)現(xiàn),利用抗原呈遞細胞(尤其是DCs)和腫瘤細胞的融合細胞疫苗來誘導抗腫瘤免疫已經成為學術界的關注領域。而BTSCs的發(fā)現(xiàn),又進一步為腦膠質瘤的免疫治療提供了
8、新的思路。相對于腫瘤細胞與DCs融合的腫瘤免疫治療能有效抑制腫瘤生長的前期工作,BTSCs與DCs融合的膠質瘤免疫治療將更具優(yōu)勢,更為理想。 本研究將從手術中獲取的不同級別腦膠質瘤標本進行免疫磁珠分選,得到CD133+和CD133-的膠質瘤細胞,并抽取同一個病人的外周血,分離得到樹突狀細胞,用電融合的方法,分別把CD133+和CD133-膠質瘤細胞與同源的樹突狀細胞融合,融合后的兩種細胞分別用于刺激同源的T淋巴細胞,再用這些致敏
9、的T淋巴細胞,殺傷同源的原代膠質瘤細胞,觀察該方法是否能更有效的殺傷膠質瘤細胞。 二、方法: 本實驗分為三部分: 第一部分:原代CD133+和CD133-的膠質瘤細胞獲得和分選。 收集手術中取得的膠質瘤標本,經過剪切、消化等措施,用DMEM/F12培養(yǎng)基加胎牛血清原代培養(yǎng),培養(yǎng)至第3~5天取部分原代細胞、用流式細胞儀檢測其中CD133陽性細胞的表達率,再取部分細胞用免疫磁珠分選法分選其中的CD133+膠質
10、瘤細胞。分選后的CD133+膠質瘤細胞在DMEM/F12培養(yǎng)基加B27、堿性成纖維生長因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)、表皮生長因子(epidermal.growthfactor,EGF)和白血病細胞抑制因子(Leukemiainhibitoryfactor,LIF)等細胞因子,原代無血清培養(yǎng)成懸浮腫瘤球后用帶有紅色熒光標記物(藻紅蛋白標記,Phycoerythrin,PE)的羊抗人CD133抗體
11、標記,熒光顯微鏡下觀察。主要觀察和比較CD133+細胞和CD133-細胞在第7天、第14天光鏡下20個隨機視野膠質瘤細胞腫瘤球的數(shù)目;形成的腫瘤球再放入含有胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,并于第8天用免疫細胞化學法檢測貼壁的腫瘤球NSE和GFAP表型。 第二部分:DCs的誘導培養(yǎng)和鑒定。 用淋巴分離液分離膠質瘤患者外周血單個核細胞(Peripheralbloodmononeuclearcells,PBMCs),培養(yǎng)2小
12、時后的貼壁PBMCs,用含有粒-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF)和白細胞介素(Interleukin-4,IL-4)的培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2,的恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng),第5天開始加腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor-α,TNF-α),刺激DCs成熟,在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。在第8~10天收獲成熟的DCs,并用流式細胞儀檢
13、測DCs表面的CD14、CD83、CD80、人類白細胞抗原(HumanleukocyteantigensD-related,HLA-DR)、CD1a和CD86六種表面標志物。 第三部分:融合瘤苗的制備,T淋巴細胞的制備及體外刺激和細胞毒性實驗。 CD133+和CD133-的膠質瘤細胞的分選同第一部分。DCs的誘導培養(yǎng)同第二部分。利用電融合的方法將DCs與CD133+和CD133-的膠質瘤細胞分別按5:1的比例進行融合。并
14、用DCs與轉染有綠色熒光蛋白的膠質瘤細胞融合,通過熒光顯微鏡下觀察及流式細胞儀檢測來鑒定融合。 用人T細胞富集液(HumanTcellenrichmentcocktail)(StemCell公司產品)孵育抽取的膠質瘤患者同源外周血,再用淋巴細胞分離液分離這部分外周血,得到T淋巴細胞;用白細胞介素(Interleukin-2,IL-2)加入到含有血清的RPMI1640培養(yǎng)基,培養(yǎng)T淋巴細胞;用流式細胞儀檢測淋巴細胞表面CD3分子。
15、 三、結果: 不同原代膠質瘤細胞中含有約0.8%~12.4%的CD133+膠質瘤細胞,熒光顯微鏡下示腫瘤球成紅色熒光,表明攜帶有CD133表面分子,CD133+細胞比CD133-細胞具有明顯增殖能力,且CD133+細胞能分化成表達NSE和GFAP表面分子的腫瘤細胞。(圖1-1,1-2,1-3)。這類細胞在膠質瘤組織中的含量非常稀少,大部分在1%左右,在惡性程度較高的膠質瘤組織(膠質瘤病理分級為IV級)中含量較高,可達10
16、%以上。養(yǎng)第8~10天的DCs,在倒置顯微鏡下表現(xiàn)為大量突起和毛刺,符合成熟DCs的形態(tài);流式細胞儀檢測結果顯示,PBMCs標志物CD14低表達,DCs表面標志物HLA-DR、CD80、CD86等表面分子高表達(表2-1)。 四、結論: 原代膠質瘤組織細胞經免疫磁珠分選法分選后,在含有B27、EGF、bFGF和LIF細胞因子的DMEM/F12培養(yǎng)基內,能成功培養(yǎng)出CD133+細胞。這類細胞懸浮生長在上述培養(yǎng)基內,可增殖成
17、有許多細胞組成的細胞球。把這些細胞球轉入含有血清的DMEM/F12培養(yǎng)基內后,可貼壁生長、并向表達NSE、GFAP的下級細胞分化。而CD133-細胞則很難在上述無血清培養(yǎng)基內長期分裂增殖。 膠質瘤患者外周血單個核細胞經GM-CSF、IL-4、TNF-α等細胞因子刺激誘導培養(yǎng),可獲取具備典型特征及細胞表型的成熟DCs。膠質瘤干細胞與DCs經電融合,可成功獲得融合瘤苗,融合瘤苗體積明顯增大,具有活化T淋巴細胞分泌IFN-γ的功效。
18、 細胞毒性殺傷實驗表明,CD133+細胞與DCs的融合細胞、CD133-細胞與DCs的融合細胞均能明顯活化T淋巴細胞殺傷膠質瘤細胞,而單純DCs、單純膠質瘤細胞以及DCs與膠質瘤細胞混合培養(yǎng)的細胞則均不能產生顯著的細胞毒性T淋巴細胞(CytotoxicTlymphocy,CTL)反應,兩種融合細胞分別活化的T淋巴細胞之間差異沒有顯著統(tǒng)計學意義。通過檢測IFN-γ釋放量說明,融合細胞能顯著刺激T淋巴細胞分泌IFN-γ,而兩種融合細胞
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