腦腫瘤干細胞及其免疫治療的前期實驗研究.pdf

1、一、目的意義: 腦腫瘤嚴重危害人類健康。據(jù)統(tǒng)計，惡性腦腫瘤占人類所有癌癥患者的2％，占兒童全身腫瘤發(fā)病率的20％～25％，綜合發(fā)病年齡高峰在30～40歲，或10～20歲。其中又以膠質(zhì)細胞瘤發(fā)病率最高，約占惡性腦腫瘤40.49％。膠質(zhì)母細胞瘤是最常見的成人原發(fā)性惡性腦腫瘤，病人從確診開始的中間生存時間是15個月，由于膠質(zhì)細胞瘤分化不全、且深入神經(jīng)細胞深處，常規(guī)的抗腫瘤措施，包括手術(shù)、放療和化療都很難有效根除，導(dǎo)致其復(fù)發(fā)率較高。最近

2、研究發(fā)現(xiàn)，在腦膠質(zhì)瘤中存在一種數(shù)量極少具有干細胞的特性的細胞，正是這類細胞導(dǎo)致膠質(zhì)瘤產(chǎn)生和復(fù)發(fā)，這類細胞已經(jīng)定義為腦腫瘤干細胞(Braintumorstemcells，BTSCs)。 BTSCs存在于惡性腦膠質(zhì)瘤的事實最早由Ignatova等(2002年)報道，他們將腦膠質(zhì)瘤細胞在神經(jīng)干細胞(Neuralstemcells，NSCs)培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有克隆形成，其細胞表達NSCs標記物Nestin，分化細胞則同時或單

3、獨表達神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronespecificenolase，NSE)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)和神經(jīng)元β-Ⅲ微管蛋白(neuronalbeta-Ⅲtubulin)等并有基因轉(zhuǎn)錄，提示這類細胞具有NSCs特性，具有為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的能力因而，把這類細胞稱為腫瘤干細胞樣細胞(tumorstem-likecells)，并認為其與腫瘤起源和生長有關(guān)。此后，又有

4、Singh等(2004年)發(fā)現(xiàn)，腦腫瘤中幾乎所有的細胞增殖均由一小部分表達人類干細胞標志物CD133+的細胞即BTSCs產(chǎn)生。在培養(yǎng)基中，這些細胞可以增殖并分化為神經(jīng)元和(或)膠質(zhì)細胞，比例、表型與原腫瘤一致。這些新生的腫瘤細胞又可以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生新的腫瘤細胞，證明它們是腫瘤細胞而不是被腫瘤樣本污染的正常NSCs。Hemmati等(2003年)對小兒髓母細胞瘤和膠質(zhì)瘤進行研究，也發(fā)現(xiàn)存在與NSCs性質(zhì)相似的細胞，它們在體外可形成神經(jīng)球，

5、能夠自我更新，且具有多分化潛能，在一定環(huán)境中可分化成具有神經(jīng)元和/或膠質(zhì)細胞表面標志的細胞，細胞比例與原腫瘤相似，提示其參與了腦腫瘤的形成；與正常NSCs不同的是，這些細胞表現(xiàn)出異常的增殖能力，其共同特征是：(1)表達NSCs特異性標記，如Nestin、CD133等；(2)具有自我更新和增殖能力，可以成為永生細胞；(3)在異體原位移植后，可以分化為與原腫瘤相似表型和核型的腫瘤。 樹突狀細胞(dendriticcells，DCs)

6、是體內(nèi)的專職抗原呈遞細胞，具有活躍地攝取、處理抗原的能力，并表達高水平的主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)-I、II類抗原和CD80、CD86等共刺激分子，因而能有效地向T細胞呈遞抗原、激發(fā)初次細胞免疫應(yīng)答。利用DCs的這一重要功能，基于DCs的腫瘤疫苗是腫瘤免疫治療的重要途徑之一，并結(jié)合BTSCs特點，本研究以臨床膠質(zhì)瘤組織為研究對象，在分別分離純化鑒定BTSCs及DCs的基礎(chǔ)

7、上、重點探討以BTSCs為免疫原性的DCs融合瘤苗對膠質(zhì)瘤的免疫殺傷作用，探討免疫治療新方法。DCs疫苗的構(gòu)建方法很多，如腫瘤細胞mRNA沖擊DCs法、腫瘤細胞抗原多肽沖擊DCs法、腫瘤細胞裂解物沖擊DCs法、抗原基因修飾DCs法等。隨著對腫瘤細胞融合特性研究的深入以及樹突狀細胞的發(fā)現(xiàn)，利用抗原呈遞細胞(尤其是DCs)和腫瘤細胞的融合細胞疫苗來誘導(dǎo)抗腫瘤免疫已經(jīng)成為學(xué)術(shù)界的關(guān)注領(lǐng)域。而BTSCs的發(fā)現(xiàn)，又進一步為腦膠質(zhì)瘤的免疫治療提供了

8、新的思路。相對于腫瘤細胞與DCs融合的腫瘤免疫治療能有效抑制腫瘤生長的前期工作，BTSCs與DCs融合的膠質(zhì)瘤免疫治療將更具優(yōu)勢，更為理想。 本研究將從手術(shù)中獲取的不同級別腦膠質(zhì)瘤標本進行免疫磁珠分選，得到CD133+和CD133-的膠質(zhì)瘤細胞，并抽取同一個病人的外周血，分離得到樹突狀細胞，用電融合的方法，分別把CD133+和CD133-膠質(zhì)瘤細胞與同源的樹突狀細胞融合，融合后的兩種細胞分別用于刺激同源的T淋巴細胞，再用這些致敏

9、的T淋巴細胞，殺傷同源的原代膠質(zhì)瘤細胞，觀察該方法是否能更有效的殺傷膠質(zhì)瘤細胞。 二、方法: 本實驗分為三部分： 第一部分：原代CD133+和CD133-的膠質(zhì)瘤細胞獲得和分選。 收集手術(shù)中取得的膠質(zhì)瘤標本，經(jīng)過剪切、消化等措施，用DMEM/F12培養(yǎng)基加胎牛血清原代培養(yǎng)，培養(yǎng)至第3～5天取部分原代細胞、用流式細胞儀檢測其中CD133陽性細胞的表達率，再取部分細胞用免疫磁珠分選法分選其中的CD133+膠質(zhì)

10、瘤細胞。分選后的CD133+膠質(zhì)瘤細胞在DMEM/F12培養(yǎng)基加B27、堿性成纖維生長因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)、表皮生長因子(epidermal.growthfactor,EGF)和白血病細胞抑制因子(Leukemiainhibitoryfactor,LIF)等細胞因子，原代無血清培養(yǎng)成懸浮腫瘤球后用帶有紅色熒光標記物(藻紅蛋白標記，Phycoerythrin，PE)的羊抗人CD133抗體

11、標記，熒光顯微鏡下觀察。主要觀察和比較CD133+細胞和CD133-細胞在第7天、第14天光鏡下20個隨機視野膠質(zhì)瘤細胞腫瘤球的數(shù)目；形成的腫瘤球再放入含有胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，并于第8天用免疫細胞化學(xué)法檢測貼壁的腫瘤球NSE和GFAP表型。 第二部分：DCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)和鑒定。 用淋巴分離液分離膠質(zhì)瘤患者外周血單個核細胞(Peripheralbloodmononeuclearcells，PBMCs)，培養(yǎng)2小

12、時后的貼壁PBMCs，用含有粒-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，GM-CSF)和白細胞介素(Interleukin-4，IL-4)的培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2，的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第5天開始加腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)，刺激DCs成熟，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。在第8～10天收獲成熟的DCs，并用流式細胞儀檢

13、測DCs表面的CD14、CD83、CD80、人類白細胞抗原(HumanleukocyteantigensD-related，HLA-DR)、CD1a和CD86六種表面標志物。 第三部分：融合瘤苗的制備，T淋巴細胞的制備及體外刺激和細胞毒性實驗。 CD133+和CD133-的膠質(zhì)瘤細胞的分選同第一部分。DCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)同第二部分。利用電融合的方法將DCs與CD133+和CD133-的膠質(zhì)瘤細胞分別按5:1的比例進行融合。并

14、用DCs與轉(zhuǎn)染有綠色熒光蛋白的膠質(zhì)瘤細胞融合，通過熒光顯微鏡下觀察及流式細胞儀檢測來鑒定融合。 用人T細胞富集液(HumanTcellenrichmentcocktail)(StemCell公司產(chǎn)品)孵育抽取的膠質(zhì)瘤患者同源外周血，再用淋巴細胞分離液分離這部分外周血，得到T淋巴細胞；用白細胞介素(Interleukin-2，IL-2)加入到含有血清的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)T淋巴細胞；用流式細胞儀檢測淋巴細胞表面CD3分子。

15、 三、結(jié)果: 不同原代膠質(zhì)瘤細胞中含有約0.8％～12.4％的CD133+膠質(zhì)瘤細胞，熒光顯微鏡下示腫瘤球成紅色熒光，表明攜帶有CD133表面分子，CD133+細胞比CD133-細胞具有明顯增殖能力，且CD133+細胞能分化成表達NSE和GFAP表面分子的腫瘤細胞。(圖1-1，1-2，1-3)。這類細胞在膠質(zhì)瘤組織中的含量非常稀少，大部分在1％左右，在惡性程度較高的膠質(zhì)瘤組織(膠質(zhì)瘤病理分級為IV級)中含量較高，可達10

16、％以上。養(yǎng)第8～10天的DCs，在倒置顯微鏡下表現(xiàn)為大量突起和毛刺，符合成熟DCs的形態(tài)；流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，PBMCs標志物CD14低表達，DCs表面標志物HLA-DR、CD80、CD86等表面分子高表達(表2-1)。 四、結(jié)論: 原代膠質(zhì)瘤組織細胞經(jīng)免疫磁珠分選法分選后，在含有B27、EGF、bFGF和LIF細胞因子的DMEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)，能成功培養(yǎng)出CD133+細胞。這類細胞懸浮生長在上述培養(yǎng)基內(nèi)，可增殖成

17、有許多細胞組成的細胞球。把這些細胞球轉(zhuǎn)入含有血清的DMEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)后，可貼壁生長、并向表達NSE、GFAP的下級細胞分化。而CD133-細胞則很難在上述無血清培養(yǎng)基內(nèi)長期分裂增殖。 膠質(zhì)瘤患者外周血單個核細胞經(jīng)GM-CSF、IL-4、TNF-α等細胞因子刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)，可獲取具備典型特征及細胞表型的成熟DCs。膠質(zhì)瘤干細胞與DCs經(jīng)電融合，可成功獲得融合瘤苗，融合瘤苗體積明顯增大，具有活化T淋巴細胞分泌IFN-γ的功效。

18、 細胞毒性殺傷實驗表明，CD133+細胞與DCs的融合細胞、CD133-細胞與DCs的融合細胞均能明顯活化T淋巴細胞殺傷膠質(zhì)瘤細胞，而單純DCs、單純膠質(zhì)瘤細胞以及DCs與膠質(zhì)瘤細胞混合培養(yǎng)的細胞則均不能產(chǎn)生顯著的細胞毒性T淋巴細胞(CytotoxicTlymphocy,CTL)反應(yīng)，兩種融合細胞分別活化的T淋巴細胞之間差異沒有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。通過檢測IFN-γ釋放量說明，融合細胞能顯著刺激T淋巴細胞分泌IFN-γ，而兩種融合細胞