雞血藤促進(jìn)造血功能的物質(zhì)基礎(chǔ)和機(jī)制研究.pdf

1、雞血藤是傳統(tǒng)中藥中一味典型的活血化瘀藥，主產(chǎn)于廣東、廣西、云南等省。雞血藤性溫，味苦、甘，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)血、活血、通絡(luò)之功效，在民間常用來(lái)治療腰膝酸痛、麻木癱瘓、血虛萎黃及月經(jīng)不調(diào)等疾病?，F(xiàn)代藥理研究表明：雞血藤有抑制血小板聚集、降低血壓、抗心律失常等作用。臨床常用雞血藤(單用或以雞血藤為主組方)治療各種原因(如放化療、血液系統(tǒng)疾病)引起的白細(xì)胞、血小板及紅細(xì)胞等全血象減少疾病。 關(guān)于雞血藤的本草考證，過(guò)去研究較為混亂，

2、雞血藤的原植物分屬于豆科和五味子科。直至1995年，《中華人民共和國(guó)藥典》1995年版將雞血藤定為顯科植物密花豆Spatholobus suberectus Dun 的干燥藤莖，解決了其本草考證的爭(zhēng)議。與本草考證類(lèi)似，雞血藤的化學(xué)成分研究也十分不足。資料表明，近年僅有少數(shù)研究對(duì)雞血藤的化學(xué)成分進(jìn)行了初步分析，但對(duì)其具體藥效成分還不明確。雖然《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版中以芒柄花素作為雞血藤鑒別的標(biāo)準(zhǔn)之一，但目前研究尚不能確定其即為

3、雞血藤促進(jìn)造血功能的有效成分。由于有效成分的不明確，造成了目前研究對(duì)雞血藤促進(jìn)造血功能的作用機(jī)理的不明確。 針對(duì)以上現(xiàn)狀，本論文首先系統(tǒng)研究了雞血藤的促進(jìn)造血功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，通過(guò)有機(jī)溶劑提取、硅膠層析和凝膠層析，分離得到了雞血藤的促進(jìn)造血功能的有效成分，通過(guò)液質(zhì)、紅外光譜和核磁共振方法對(duì)雞血藤的有效成分鑒定了結(jié)構(gòu)鑒定。在以上研究的基礎(chǔ)上，本論文進(jìn)一步并對(duì)雞血藤有效成分的促進(jìn)造血功能作用機(jī)理，采用多種動(dòng)物模型，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)

4、物整體、細(xì)胞和分子水平上進(jìn)行了詳細(xì)的研究，基本明確了雞血藤有效成分的作用機(jī)理。 本論文主要開(kāi)展了以下的研究工作： l、以乙酰苯肼聯(lián)合環(huán)磷酰胺所致小鼠復(fù)合貧血模型為藥效篩選平臺(tái)，通過(guò)乙醇提取，有機(jī)溶劑萃取，索氏回流提取、硅膠層析和Sephadex LH-20凝膠層析方法對(duì)雞血藤的有效成分進(jìn)行了提取、分離和篩選。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，最終確定了雞血藤有效成分的提取工藝，并獲得了雞血藤促進(jìn)造血功能的有效成分。 2、采用液質(zhì)、紅外光

5、譜和核磁共振法對(duì)分離得到的有效成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，并確定該成分為兒茶素(catechin)。 3、研究了兒茶素對(duì)模型小鼠外周血象的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腹腔注射不同劑量的兒茶素能夠?qū)σ阴１诫侣?lián)合環(huán)磷酰胺所致小鼠復(fù)合貧血模型，環(huán)磷酰胺所致小鼠骨髓抑制模型和小鼠急性失血性貧血模型的外周血象有不同程度的恢復(fù)，其中腹腔注射兒茶素24mg／kg時(shí)效果最為明顯，對(duì)乙酰苯肼聯(lián)合環(huán)磷酰胺所致小鼠復(fù)合貧血模型的白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血紅蛋白分別提高50.

6、0％，26.O％和16.6％；對(duì)環(huán)磷酰胺所致小鼠骨髓抑制模型的白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血紅蛋白分別提高42.5％，28.1％和12.2％；對(duì)小鼠急性失血性貧血模型的紅細(xì)胞和血紅蛋白分別提高19.4％和16.9％，給藥組與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)。以上結(jié)果表明，兒茶素具有促進(jìn)造血功能的作用，能夠恢復(fù)多種模型小鼠的外周血象。 4、以MTT比色法檢測(cè)骨髓細(xì)胞增殖能力，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腹腔注射兒茶素24mg／kg時(shí)，能有效促進(jìn)正常小鼠的

7、骨髓細(xì)胞增殖，提高達(dá)到了13.2％，差異極顯著(P<0.01)；與乙酰苯肼聯(lián)合環(huán)磷酰胺所致小鼠復(fù)合貧血模型相比，造模同時(shí)腹腔注射兒茶素24mg／kg組的小鼠骨髓細(xì)胞顯著增多，提高達(dá)到了37.5％，呈極顯著差異(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)表明，兒茶素能夠顯著促進(jìn)小鼠骨髓細(xì)胞的增殖能力。 5、通過(guò)脾結(jié)節(jié)生成實(shí)驗(yàn)，研究了兒茶素對(duì)骨髓造血干細(xì)胞增殖的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，兒茶素能提高正常小鼠的骨髓細(xì)胞分裂能力，呈顯著性差異(P<0.0

8、5)；與乙酰苯肼聯(lián)合環(huán)磷酰胺所致小鼠復(fù)合貧血模型組比較，兒茶素能提高模型組小鼠的骨髓細(xì)胞分裂能力，差異極顯著(P<0.01)。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，表明兒茶素能夠促進(jìn)小鼠骨髓造血干細(xì)胞的分裂增殖能力，從而促進(jìn)模型小鼠造血功能的恢復(fù)。 6、通過(guò)甲基纖維素半固體培養(yǎng)基集落形成實(shí)驗(yàn)對(duì)兒茶素促進(jìn)CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-Meg的生成能力進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腹腔注射兒茶素24 mg／kg，與空白組相比，其CFU-GM有顯

9、著增加，有顯著差異(P<0.05)，對(duì)CFU-E,BFU-E、CFU-Meg雖有一定促進(jìn)作用，但未見(jiàn)顯著性差異；與乙酰苯肼聯(lián)合環(huán)磷酰胺所致小鼠復(fù)合貧血模型相比，腹腔注射兒茶素24 mg／kg組的CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-Meg集落數(shù)均明顯增加，呈極顯著差異(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兒茶素對(duì)造血祖細(xì)胞的生成能力有顯著提高，是促進(jìn)造血功能的主要原因之一。 7、以造血生長(zhǎng)因子生物活性檢測(cè)技術(shù)測(cè)定兒茶素促進(jìn)小鼠

10、細(xì)胞集落刺激因子(CSFs)分泌的影響，實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)兒茶素體內(nèi)誘導(dǎo)所制備的巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞、肺和骨骼肌體外條件培養(yǎng)液能明顯促進(jìn)正常小鼠和貧血小鼠骨髓細(xì)胞增殖(P<0.01)。 8、檢測(cè)了正常和模型小鼠細(xì)胞分泌白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素3(IL-3)的影響，實(shí)驗(yàn)表明，兒茶素可顯著提高正常和模型小鼠細(xì)胞IL-1、IL-2、IL-3的分泌能力。 9、觀察了兒茶素對(duì)正常小鼠和模型小鼠脾細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)

11、生紅細(xì)胞生成素的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兒茶素模型組與模型組相比小鼠脾條件培養(yǎng)液中紅細(xì)胞生成素的生成有極顯著性差異，Epo生成量提高28.7％。兒茶素對(duì)正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中Epo生成有顯著促進(jìn)作用，與空白組相比提高了21.8％。 10、探討了兒茶素對(duì)正常小鼠和模型小鼠的骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌TNF的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兒茶素能抑制貧血模型小鼠的骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌TNF。 以上7、8、9、10點(diǎn)的研究表明，兒茶素能夠調(diào)節(jié)正常小鼠和模型小

12、鼠體內(nèi)造血相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，其能夠增加體內(nèi)正向造血因子，如CSFs、IL-1、IL-2、IL-3、Epo等的分泌，同時(shí)抑制負(fù)向造血因子TNF的分泌，從而促進(jìn)小鼠造血細(xì)胞的生存、增殖和分化，達(dá)到促進(jìn)造血功能的功效。 11、利用<'60>Co γ射線一次性全身照射小鼠，動(dòng)態(tài)觀察其骨髓細(xì)胞、脾細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)觀察到照射后模型組小鼠骨髓細(xì)胞在6 h其凋亡數(shù)最多，以后隨 時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減少，兒茶素組小鼠骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞凋亡數(shù)與模型組

13、相比兩 者在6 h處有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)：在12，18，24 h也能相應(yīng)的拮抗 細(xì)胞的凋亡。以上實(shí)驗(yàn)表明，兒茶素能夠?qū)馆椛渌碌墓撬杓?xì)胞和脾細(xì)胞凋亡，對(duì)造血細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。 12、利用基因芯片技術(shù)，檢測(cè)了兒茶素對(duì)乙酰苯肼聯(lián)合環(huán)磷酰胺所致小鼠復(fù)合貧血模型的基因表達(dá)譜的影響。通過(guò)提取模型給藥組和模型組小鼠骨髓細(xì)胞RNA，進(jìn)一步檢測(cè)其中差異表達(dá)基因，結(jié)果顯示，兒茶素在小鼠體內(nèi)改變了多種其它基因的表達(dá)，