半乳糖化殼聚糖-低分子量聚乙烯亞胺-DNA復(fù)合物的肝靶向性基因轉(zhuǎn)導(dǎo)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建去唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)的半乳糖基-殼聚糖-聚乙烯亞胺肝靶向非病毒轉(zhuǎn)基因載體，研究其在體內(nèi)外的肝靶向轉(zhuǎn)染效率。 方法： 第一部分：以殼聚糖和乳糖酸先合成半乳糖化殼聚糖作為去唾液酸糖蛋白受體的配體，再通過(guò)透析法在半乳糖殼聚糖的骨架上偶聯(lián)低分子量PEI，合成半乳糖化殼聚糖.聚乙烯亞胺聚合物，與pEGFP-C1在0.01M PBS、150mmol/L NaCl、5％GS中自組裝成三種不同溶媒介導(dǎo)的GC-PEI/ DNA

2、復(fù)合物。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究三種GC-PEI/DNA復(fù)合物結(jié)合和組裝DNA能力，并通過(guò)血清和DNaseⅠ消化實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)GC-PEI復(fù)合物對(duì)DNA的保護(hù)能力。為了篩選出最合適的GC-PEI/DNA復(fù)合物及其最佳質(zhì)量比，選用透射電子顯微鏡和粒徑分析儀來(lái)檢測(cè)復(fù)合物粒徑大小及形態(tài)，粒徑分析儀進(jìn)行Zeta電位測(cè)定。 第二部分：在體外通過(guò)MTT法檢測(cè)聚合物對(duì)5種細(xì)胞（QSG7701、QSG7701/ core、L02、SGC-7

3、901、HBE）的毒性，并將聚合物尾靜脈注入小鼠觀察其體內(nèi)急性毒性反應(yīng)。 第三部分：GC-PEI聚合物在體內(nèi)外的肝靶向轉(zhuǎn)染效率研究。GC-PEI/DNA復(fù)合物分別轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞系（QSG7701，QSG7701/core，L02）及非肝細(xì)胞系（SGC-7901、HBE）細(xì)胞，以陽(yáng)離子脂質(zhì)體lipofectamine TM2000、裸DNA分別做為陽(yáng)、陰性對(duì)照，置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)及通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率

4、。此外，利用血清和游離半乳糖分別檢測(cè)二者對(duì)GC-PEI聚合物肝靶向轉(zhuǎn)染效率的影響。將二種不同溶媒的GC-PEI/DNA復(fù)合物經(jīng)尾靜脈注射導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，取肝、心、脾、肺、腎等主要器官做冰凍切片，置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，以裸質(zhì)粒和陽(yáng)離子脂質(zhì)體lipofect-amine TM2000作為對(duì)照。 結(jié)果： ①瓊脂糖凝膠電泳和結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三種不同溶媒的GC-PEI聚合物均能有效地結(jié)合DNA，在聚合物與DNA質(zhì)量

5、比為2.5：1時(shí)，聚合物結(jié)合DNA能力最佳，與DNA的結(jié)合率可達(dá)93％。GC-PEI/DNA復(fù)合物能保護(hù)所攜帶的DNA免受核酸酶和血清的降解。復(fù)合物粒徑大小分布于50～200nm之間時(shí)，其形成的粒子呈規(guī)則的球形，有明顯的核殼結(jié)構(gòu)。在150mmol/L NaCl中復(fù)合物粒徑最大，其次為在0.01M PBS中，在5％GS中復(fù)合物形成粒子最小。隨著聚合物與DNA質(zhì)量比的增大（0.25：1～2.5：1），復(fù)合物的粒徑、結(jié)合能力、zeta電位均發(fā)

6、生明顯的變化，其中復(fù)合物的粒徑變小，而DNA結(jié)合能力及zeta電位增大。在低質(zhì)量比時(shí)，GC-PEI/DNA復(fù)合物在150mmol/L NaCl中表現(xiàn)出不穩(wěn)定，出現(xiàn)相互聚集現(xiàn)象。 ②MTT結(jié)果表明GC-PEI聚合物在檢測(cè)范圍內(nèi)對(duì)5種細(xì)胞均未顯示出明顯毒性，相對(duì)細(xì)胞活力值均高于80％；形態(tài)學(xué)觀察顯示GC-PEI聚合物50μg/mL組與陰性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)相似。動(dòng)物體內(nèi)急性毒性實(shí)驗(yàn)顯示，通過(guò)尾靜脈注射50～300μg劑量的GC-PEI聚

7、合物入小鼠后，實(shí)驗(yàn)小鼠兩周內(nèi)無(wú)急性毒性反應(yīng)和死亡發(fā)生；通過(guò)HE染色形態(tài)學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)組小鼠主要器官無(wú)明顯病理變化。 ③熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)GC-PEI/DNA復(fù)合物在肝細(xì)胞系（QSG7701，QSG7701/ core，L02）中的GFP表達(dá)明顯高于非肝細(xì)胞系（SGC-7901，HBE）細(xì)胞。GC-PEI/DNA/PBS復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率高于GC-PEI/5％GS/DNA組。游離半乳糖可拮抗GC-PEI/DNA復(fù)合物在QSG

8、7701/core中的轉(zhuǎn)染效率。GC-PEI/DNA復(fù)合物在含血清培基中的轉(zhuǎn)染效率較無(wú)血清時(shí)略有下降。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染48小時(shí)后兩復(fù)合物組（GC-PEI/PBS/DNA、GC-PEI/5％GS/DNA）的小鼠肝組織在熒光顯微鏡下可以明顯檢測(cè)到綠色熒光點(diǎn)，于轉(zhuǎn)染1周后熒光表達(dá)減弱；而心、脾、肺、腎等余主要器官中檢測(cè)不到GFP表達(dá)；兩對(duì)照組肝組織中未見(jiàn)明顯熒光。 結(jié)論： （1）GC-PEI聚合物能夠在體內(nèi)外特異性將外源基因?qū)?/p>