2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、基因治療在人類嚴重疾病治療中具有重大的潛力和應用前景,其中通過siRNA(small interfering RNA)誘導RNAi(RNA interfering)來抑制mRNA表達是治療腫瘤的一種新的途徑途徑。但是siRNA在體內(nèi)使用時存在穩(wěn)定性差、轉染效率低的問題,因此siRNA在體內(nèi)使用時需要一種有效的基因載體系統(tǒng)。本研究開發(fā)NGR多肽修飾的脂質(zhì)-聚乙烯亞胺(BPEI)-siRNA復合物(NGR-Lipo/BPEI/siRNA)作

2、為非病毒基因載體,主要包括以下內(nèi)容:
   以單因素實驗法優(yōu)化BPEI/siRNA壓縮體的制備方法。結果表明:N/P=3時,壓縮體對siRNA的包封完全;隨著N/P的增加,壓縮體粒徑減小;緩沖液的類型對壓縮體的性質(zhì)有較大的影響,在20mM HEPES中能形成穩(wěn)定的壓縮體;siRNA的濃度在0.1μM~0.5μM之間時,壓縮體的粒徑隨著siRNA濃度的增加而降低;siRNA的濃度在0.5μM~1.5μM之間時,壓縮體的粒徑隨著si

3、RNA濃度的增加而增加。根據(jù)單因素試驗結果,壓縮體制備最佳條件為:20mMHEPES(pH7.40)、N/P=10、CsiRNA=1μM,所得壓縮體粒徑在150nm左右、電位在30mV左右、siRNA的包封率高、穩(wěn)定性較好。
   以逆向蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體,包載BPEI/siRNA形成Lipo/BPEI/siRNA,考察其包封率。采用正交實驗法優(yōu)化Lipo/BPEI/siRNA的制備條件:磷脂:膽固醇(W/W)=2:1、油:水(V

4、/V)=4:1、探超功率200w;利用NGR多肽中巰基與Lipo/BPEI/siRNA表面的馬來酰亞胺基團發(fā)生加成反應,對Lipo/BPEI/siRNA進行靶向修飾。結果顯示:NGR多肽能有效連接在Lipo/BPEI/siRNA的表面,NGR-Lipo/BPEI/siRNA粒徑在120nm左右、電位在-20mV左右,siRNA包封率高,在含血清的培養(yǎng)基中放置6h,粒徑?jīng)]有顯著變化。
   非病毒載體系統(tǒng)在水溶液中穩(wěn)定性差,因此宜

5、將其制備成凍干粉保存。單因素實驗法優(yōu)化凍干保護劑的濃度和種類,選擇1.5%蔗糖和1.5%海藻糖聯(lián)合使用。制備的NGR-Lipo/BPEI/siRNA凍干粉外觀較好,粒徑、電位變化較小,siRNA包封率高,4℃放置三個月,穩(wěn)定性良好。
   體外細胞增殖抑制實驗考察NGR-Lipo/BPEI/siRNA對MCF-7細胞增殖抑制,結果顯示:抑制率具有濃度和時間依賴性,抑制率隨著siRNA濃度的增加、作用時間的延長而增加;體外細胞攝取

6、實驗和流式細胞檢測法考察體外MCF-7細胞對NGR-Lipo/BPEI/siRNA的攝取,結果顯示:相對于siRNA,MCF-7細胞均能攝取NGR-Lipo/BPEI/siRNA、Lipo/BPEI/siRNA和BPEI/siRNA,且NGR-Lipo/BPEI/siRNA具有更高的轉染效率;RT-PCR考察NGR-Lipo/BPEI/siRNA對Bmi-1 mRNA表達的影響,結果顯示:NGR-Lipo/BPEI/siRNA能有效降低

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