腫瘤靶向脂質(zhì)-聚乙烯亞胺-siRNA復(fù)合物的研究.pdf

1、基因治療在人類嚴(yán)重疾病治療中具有重大的潛力和應(yīng)用前景，其中通過(guò)siRNA（small interfering RNA）誘導(dǎo)RNAi(RNA interfering)來(lái)抑制mRNA表達(dá)是治療腫瘤的一種新的途徑途徑。但是siRNA在體內(nèi)使用時(shí)存在穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)染效率低的問(wèn)題，因此siRNA在體內(nèi)使用時(shí)需要一種有效的基因載體系統(tǒng)。本研究開發(fā)NGR多肽修飾的脂質(zhì)-聚乙烯亞胺(BPEI)-siRNA復(fù)合物(NGR-Lipo/BPEI/siRNA)作

2、為非病毒基因載體，主要包括以下內(nèi)容：
　　 以單因素實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化BPEI/siRNA壓縮體的制備方法。結(jié)果表明：N/P=3時(shí)，壓縮體對(duì)siRNA的包封完全；隨著N/P的增加，壓縮體粒徑減??；緩沖液的類型對(duì)壓縮體的性質(zhì)有較大的影響，在20mM HEPES中能形成穩(wěn)定的壓縮體；siRNA的濃度在0.1μM～0.5μM之間時(shí)，壓縮體的粒徑隨著siRNA濃度的增加而降低；siRNA的濃度在0.5μM～1.5μM之間時(shí)，壓縮體的粒徑隨著si

3、RNA濃度的增加而增加。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，壓縮體制備最佳條件為：20mMHEPES(pH7.40)、N/P=10、CsiRNA=1μM，所得壓縮體粒徑在150nm左右、電位在30mV左右、siRNA的包封率高、穩(wěn)定性較好。
　　 以逆向蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體，包載BPEI/siRNA形成Lipo/BPEI/siRNA，考察其包封率。采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化Lipo/BPEI/siRNA的制備條件：磷脂：膽固醇(W/W)=2:1、油：水(V

4、/V)=4:1、探超功率200w;利用NGR多肽中巰基與Lipo/BPEI/siRNA表面的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)發(fā)生加成反應(yīng)，對(duì)Lipo/BPEI/siRNA進(jìn)行靶向修飾。結(jié)果顯示：NGR多肽能有效連接在Lipo/BPEI/siRNA的表面，NGR-Lipo/BPEI/siRNA粒徑在120nm左右、電位在-20mV左右，siRNA包封率高，在含血清的培養(yǎng)基中放置6h，粒徑?jīng)]有顯著變化。
　　 非病毒載體系統(tǒng)在水溶液中穩(wěn)定性差，因此宜

5、將其制備成凍干粉保存。單因素實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化凍干保護(hù)劑的濃度和種類，選擇1.5％蔗糖和1.5％海藻糖聯(lián)合使用。制備的NGR-Lipo/BPEI/siRNA凍干粉外觀較好，粒徑、電位變化較小，siRNA包封率高，4℃放置三個(gè)月，穩(wěn)定性良好。
　　 體外細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)考察NGR-Lipo/BPEI/siRNA對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制，結(jié)果顯示：抑制率具有濃度和時(shí)間依賴性，抑制率隨著siRNA濃度的增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；體外細(xì)胞攝取

6、實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞檢測(cè)法考察體外MCF-7細(xì)胞對(duì)NGR-Lipo/BPEI/siRNA的攝取，結(jié)果顯示：相對(duì)于siRNA，MCF-7細(xì)胞均能攝取NGR-Lipo/BPEI/siRNA、Lipo/BPEI/siRNA和BPEI/siRNA，且NGR-Lipo/BPEI/siRNA具有更高的轉(zhuǎn)染效率；RT-PCR考察NGR-Lipo/BPEI/siRNA對(duì)Bmi-1 mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果顯示：NGR-Lipo/BPEI/siRNA能有效降低