TIGAR通過增加NADPH在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用.pdf

1、目的：觀察腦缺血對(duì) TIAGR表達(dá)的影響；TIGAR對(duì)缺血性神經(jīng)損傷的影響和TIGAR發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的初步機(jī)制。
　　方法：采用小鼠短暫性大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注(transient middle cerebral artery occlusion/reperfusion, MCAO/R)模型和體外培養(yǎng)原代神經(jīng)元缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧（oxygen glucose dripivation/reoxygenation，OGD/R）模型。在

2、動(dòng)物模型上，免疫熒光法和Western blot檢測(cè)TIGAR表達(dá)的細(xì)胞類型。Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)法檢測(cè)小鼠大腦缺血皮層TIGAR的 mRNA，p53和NOX4蛋白表達(dá)的變化。Western blot檢測(cè)p53的抑制劑(Pifithrin-α，PFT-α)對(duì)小鼠缺血皮層區(qū)TIGAR表達(dá)的影響。DHE探針標(biāo)記檢測(cè)大腦缺血皮層內(nèi)ROS變化。由慢病毒構(gòu)建的過表達(dá)TIGAR和沉默TIGAR通過側(cè)腦室注射小鼠腦內(nèi)

3、，免疫熒光法和Western blot檢測(cè) TIGAR感染率和蛋白表達(dá)；以腦梗死體積、腦水腫和行為學(xué)癥狀等指標(biāo)評(píng)價(jià)TIGAR對(duì)缺血性腦損傷的影響。在培養(yǎng)原代神經(jīng)元中給予慢病毒構(gòu)建的過表達(dá)TIGAR和沉默TIGAR處理后，免疫熒光和Western blot檢測(cè)TIGAR感染率和蛋白表達(dá)；CCK-8、LDH、TUNEL檢測(cè)TIGAR對(duì)OGD/R誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡的保護(hù)作用。DCFH2-DA和 JC-1探針標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) NADPH對(duì) OGD

4、/R誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi) ROS水平和線粒體膜電位的影響；Western blot檢測(cè) OGD/R引起的細(xì)胞凋亡蛋白 caspase-3蛋白表達(dá)變化；CCK-8、LDH、TUNEL檢測(cè)NADPH對(duì)OGD/R誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的保護(hù)作用，通過腦梗死體積、神經(jīng)癥狀評(píng)分、腦含水量測(cè)定檢測(cè) NADPH、NOX的抑制劑 apocynin、VAS2870對(duì)腦損傷程度的影響。
　　結(jié)果：與膠質(zhì)細(xì)胞相比，TIGAR高表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞中(P<0.01)。Weste

5、rn blot和RT-PCR結(jié)果顯示：缺血再灌后TIGAR，p53， NOX4表達(dá)增加；PFT-α沒有抑制缺血再灌注引起的TIGAR表達(dá)的增加。在腦缺血再灌注后ROS在0.5 h和12 h出現(xiàn)兩個(gè)峰值(P<0.01)。慢病毒構(gòu)建的 TIGAR能夠有效地地侵染腦組織，可提高或沉默TIGAR的表達(dá)(P<0.05, P<0.01)；過表達(dá)TIGAR能顯著減少tMCAO小鼠腦梗死體積，降低腦含水量，改善行為學(xué)癥狀(P<0.05, P<0.01)

6、。在原代培養(yǎng)神經(jīng)元中慢病毒構(gòu)建的過表達(dá)或干擾TIGAR有效地增加或降低TIGAR的表達(dá)。CCK-8、LDH、TUNEL結(jié)果顯示：過表達(dá)TIAGR能顯著地減少OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡(P<0.05, P<0.01)；干擾TIGAR加重OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。NADPH顯著地抑制沉默TIGAR誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示：過表達(dá) TIGAR顯著地減少 OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi) ROS水平的增強(qiáng)和抑制線粒體膜電位的降低；干擾

7、TIGAR則增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平和降低線粒體膜電位，而NADPH阻斷了干擾TIGAR的作用。Western blot顯示：過表達(dá)TIGAR降低OGD/R誘導(dǎo)的caspase-3的活化；干擾TIGAR增強(qiáng)OGD/R誘導(dǎo)的caspase-3的活化。聯(lián)合應(yīng)用NADPH和NOX的抑制劑比單應(yīng)用NADPH對(duì)減小腦梗死體積，減輕腦水腫，改善小鼠的神經(jīng)行為學(xué)障礙更為顯著。
　　結(jié)論：TIGAR對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與