Notch-Dll4和VEGF信號(hào)通路在急性髓性白血病血管新生中的交互作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分
　　 Notch/Dll4和VEGF信號(hào)通路在急性髓性白血病中的表達(dá)及臨床意義
　　 研究背景:
　　 血管新生是指在原有血管基礎(chǔ)上芽生出新的血管、廣泛重建后形成穩(wěn)定血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜過程，在實(shí)體腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及預(yù)后中發(fā)揮重要作用。越來越多的研究表明，骨髓微血管密度增多（即骨髓血管新生）對(duì)急性髓性白血病(AML)的發(fā)展、化療耐藥和預(yù)后亦有重要意義。AML骨髓微環(huán)境中血管生成刺激因子（正調(diào)節(jié)）和血管生成抑制

2、因子（負(fù)調(diào)節(jié)）的相對(duì)平衡，可控制骨髓血管生成開關(guān)，從而調(diào)控AML血管新生。其中，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)和Notch/Dll4信號(hào)通路可能是調(diào)節(jié)AML血管新生的兩個(gè)最重要機(jī)制。
　　 VEGF信號(hào)通路是調(diào)節(jié)胚胎血管發(fā)育和腫瘤血管新生的主要信號(hào)通路，對(duì)血管發(fā)育的啟動(dòng)至關(guān)重要。AML中VEGF的表達(dá)失調(diào)不僅可促進(jìn)血管新生，還能刺激AML細(xì)胞增殖、遷移。研究顯示，在初診AML患者中可檢測(cè)到VEGF和VEGFR2表達(dá)上調(diào)，且其高

3、表達(dá)的AML患者易出現(xiàn)化療藥物抵抗、預(yù)后較差，提示VEGF信號(hào)通路與AML的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切。
　　 最近研究顯示，Notch信號(hào)通路，尤其是Notch配體Dll4是另一調(diào)節(jié)腫瘤血管新生的重要信號(hào)通路。Notch信號(hào)通路在細(xì)胞增殖和分化等命運(yùn)決定中起關(guān)鍵作用，其異常調(diào)控可導(dǎo)致腫瘤等多種疾病的發(fā)生。Dll4介導(dǎo)的Notch信號(hào)通路活化對(duì)腫瘤細(xì)胞與鄰近內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用也有重要意義，可能在AML血管新生中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

4、研究表明，根據(jù)腫瘤的組織來源和細(xì)胞類型，Notch/Dll4信號(hào)通路可發(fā)揮促進(jìn)或抑制血管新生的作用。此外，該信號(hào)通路對(duì)不同腫瘤的預(yù)后影響亦存在很大差異，可能起促癌或抑癌作用。因此，闡明Notch/Dll4信號(hào)通路在AML中的預(yù)后價(jià)值對(duì)抗AML血管新生治療具有重要意義。
　　 研究顯示VEGF信號(hào)通路在血管新生中起促進(jìn)作用;Notch/Dll4信號(hào)通路則能促進(jìn)血管成熟、阻斷新生血管分支形成，抑制血管的過度增生，從而發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用，

5、提示在AML血管新生中可能同時(shí)存在這兩條正、負(fù)信號(hào)調(diào)節(jié)通路。因此，只有在VEGF和Notch/Dll4信號(hào)通路的協(xié)調(diào)作用下，AML血管新生才能有序進(jìn)行。綜上所述，AML細(xì)胞和骨髓微環(huán)境中的內(nèi)皮細(xì)胞均能分泌多種血管調(diào)節(jié)因子，并且AML血管新生依賴于這些血管調(diào)節(jié)因子的相互協(xié)調(diào)作用。因此，明確AML中血管調(diào)節(jié)因子的相互關(guān)系及臨床預(yù)后意義，可揭示AML血管新生的分子病理機(jī)制，為抗AML血管新生的治療提供新思路。
　　 研究目的:

6、　　 研究Notch/Dll4和VEGF信號(hào)通路分子(Notch1、Dll4、Hes1、VEGF、VEGFR1和VEGFR2)在AML患者外周血和骨髓中的表達(dá)水平;探討Notch/Dll4和VEGF信號(hào)通路在AML血管新生中的相互關(guān)系及臨床意義;闡明Notch1和Dll4分子異常表達(dá)對(duì)AML患者的預(yù)后影響，為AML提供新的預(yù)后指標(biāo)。
　　 研究方法:
　　 1.標(biāo)本采集:收集122例AML患者和40例健康志愿者的外周血

7、標(biāo)本，分為初診組（60例）和完全緩解組（62例）;收集60例初診AML患者和40例健康志愿者的骨髓標(biāo)本;收集8例初診AML患者和5例健康志愿者的骨髓活檢標(biāo)本，所有初診AML患者的骨髓活檢標(biāo)本中原始細(xì)胞比例大于50％。采用差速離心法分離外周血血清，采用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血或骨髓單個(gè)核細(xì)胞。
　　 2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法:血清離心去除細(xì)胞碎片，分裝并儲(chǔ)存于-20℃，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)血清中VEGF、VEGFR1

8、和VEGFR2蛋白的分泌。
　　 3.實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timeRT-PCR)法:采用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，使用M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用Real-timeRT-PCR方法檢測(cè)外周血或骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Notch1、Dll4、Hes1、VEGF、VEGFR1和VEGFR2基因mRNA水平的表達(dá)。
　　 4.Westernblot法:采用細(xì)胞裂解液RIPA提取細(xì)胞總蛋白

9、，SDS-PAGE膠進(jìn)行凝膠電泳，應(yīng)用Westernblot方法檢測(cè)外周血或骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Notch1、Dll4和Hes1蛋白水平的表達(dá)。
　　 5.免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)法:將外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液吹勻，滴加在多聚賴氨酸包被處理的玻片上，多聚甲醛固定，應(yīng)用ICC方法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中Notch1、Dll4和Hes1蛋白水平的表達(dá)。
　　 6.免疫組織化學(xué)(IHC)法:應(yīng)用IHC方法檢測(cè)骨髓活檢組織中CD34蛋白水平

10、的表達(dá)，即為骨髓微血管密度(MVD)，評(píng)價(jià)骨髓血管新生的程度;應(yīng)用IHC方法檢測(cè)骨髓活檢組織中Dll4和VEGF蛋白水平的表達(dá)。分析骨髓MVD與Dll4、VEGF蛋白表達(dá)的關(guān)系。
　　 7.統(tǒng)計(jì)分析:應(yīng)用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)、方差分析、Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析AML患者組和對(duì)照組中Notch1、Dll4、Hes1、VEGF、VEGFR1和VEGFR2等血管調(diào)節(jié)因子的表達(dá)差異;應(yīng)用Spearman秩相關(guān)分析各

11、個(gè)血管調(diào)節(jié)因子表達(dá)的相關(guān)性、血管調(diào)節(jié)因子表達(dá)和臨床特征的相關(guān)性;應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線評(píng)估各組AML患者的生存率，log-rank檢驗(yàn)比較組間生存率差異;應(yīng)用單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型評(píng)價(jià)各個(gè)因素對(duì)生存的預(yù)后影響，多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型確定與生存相關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.Notch/Dll4和VEGF信號(hào)通路分子在AML患者外周血標(biāo)本中的表達(dá):

12、
　　 ①ELISA結(jié)果顯示AML完全緩解組中血清VEGF濃度明顯高于對(duì)照組，而初診組中血清VEGF濃度明顯低于完全緩解組，初診組中血清VEGFR1、VEGFR2濃度明顯高于對(duì)照組;
　　 ②Real-timeRT-PCR結(jié)果顯示初診AML患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中Notch1、Dll4、Hes1和VEGFR2基因mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，而初診AML患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中VEGF和VEGFR1基因mRNA表達(dá)水平與對(duì)

13、照組無顯著差異;
　　 ③Westernblot和ICC結(jié)果顯示初診AML患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中Notch1、Dll4和Hes1蛋白表達(dá)水平亦明顯高于對(duì)照組;
　　 ④Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示初診AML患者外周血Notch1與VEGFR2、Dll4與VEGFR2的mRNA表達(dá)顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.483和0.426，表明AML患者外周血中存在Notch/Dll4和VEGF信號(hào)通路的異常激活。
　　

14、 2.Notch/Dll4和VEGF信號(hào)通路分子在AML患者骨髓標(biāo)本中的表達(dá):
　　 ①Real-timeRT-PCR結(jié)果顯示初診AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Notch1、Dll4、VEGF和VEGFR2基因mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，而初診AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中VEGFR1基因mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組無顯著差異;
　　 ②Westemblot結(jié)果顯示初診AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Notch1和Dll4蛋白表達(dá)水平

15、亦明顯高于對(duì)照組;
　　 ③Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示初診AML患者骨髓Notch1與Dll4、VEGF與VEGFR2、Dll4與VEGF的mRNA表達(dá)顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.326、0.354和0.663，表明AML患者骨髓中存在Notch/Dll4和VEGF信號(hào)通路的異常激活。
　　 3.AⅥL患者骨髓MVD及其與Dll4和VEGF蛋白表達(dá)的關(guān)系:
　　 ①IHC結(jié)果顯示初診AML患者骨髓MVD較

16、對(duì)照組明顯增高;初診AML患者骨髓Dll4和VEGF蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組亦明顯增高，分別為1.27-4.63和1.49-2.92倍;
　　 ②Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示骨髓MVD與Dll4和VEGF蛋白的表達(dá)顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.858和0.816，表明初診AML患者骨髓MVD顯著增加，且其與骨髓Dll4和VEGF蛋白的高表達(dá)呈正相關(guān)。
　　 4.AML患者骨髓標(biāo)本中Notch/Dll4和VEGF信號(hào)通路

17、分子表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性:
　　 ①Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示骨髓Notch1、Dll4和VEGF的mRNA表達(dá)水平與AML骨髓原始細(xì)胞比例顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.428、0.288和0.428;
　　 ②方差分析結(jié)果顯示細(xì)胞遺傳學(xué)各亞組間骨髓Dll4和VEGF的mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Notch/Dll4和VEGF信號(hào)通路分子的mRNA表達(dá)水平與性別、年齡及FAB分型無關(guān)。
　　 5.AM

18、L患者骨髓標(biāo)本中Notch/Dll4和VEGF信號(hào)通路分子表達(dá)與臨床預(yù)后的相關(guān)性:
　　 ①AML患者的中位總生存期(OS)為25個(gè)月;
　　 ②單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型顯示不良染色體核型、Notch1高表達(dá)、Dll4高表達(dá)或VEGF高表達(dá)的AML患者OS較短，多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型顯示染色體核型及Notch1、Dll4和VEGF的表達(dá)水平是影響AML患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;
　　 ③Kaplan-Me

19、ier生存曲線顯示Dll4表達(dá)的預(yù)后價(jià)值在細(xì)胞遺傳學(xué)中危組AML患者中更為顯著。Notch1和Dll4表達(dá)水平是VEGF高表達(dá)AML患者的不利預(yù)后因素。
　　 結(jié)論:
　　 1.AML患者中存在Notch/Dll4和VEGF信號(hào)通路的異?；罨?，提示這兩條信號(hào)通路可能在AML發(fā)生、發(fā)展中起作用。
　　 2.AML患者中Dll4和VEGF蛋白的異常高表達(dá)與骨髓微血管密度增高相關(guān)，提示Dll4和VEGF可能在AML血管