靶向NOTCH信號通路抑制急性白血病的分子機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分：極光激酶B（Aurora Kinase B）抑制劑AZD1152誘導(dǎo)急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞（T-ALL）凋亡的機(jī)制研究。
　　目的：急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）是由于T細(xì)胞分化異常阻滯，發(fā)生惡變并在骨髓和周血中異常增殖而引發(fā)。白血病細(xì)胞可達(dá)到血細(xì)胞總量的80％，嚴(yán)重影響正常紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的分化和功能，還可能涉及到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移，死亡率很高而且容易復(fù)發(fā)。目前認(rèn)為N

2、OTCH1是T-ALL發(fā)生中的重要癌基因。針對NOTCH1信號通路的分子靶向治療受到越來越多的關(guān)注。但是，當(dāng)今靶向NOTCH1的藥物因其非專一性導(dǎo)致的毒副作用使得在臨床試驗(yàn)中都以失敗告終。我們考察已進(jìn)入臨床試驗(yàn)期抗腫瘤藥物AURKB抑制劑AZD1152能夠特異性殺傷T-ALL細(xì)胞并闡明其作用的分子藥理機(jī)制，以期為T-ALL的靶向治療提示新思路。
　　方法：（1）CCK8法檢測AZD1152對不同T-ALL細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。（2）流

3、式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及Western blot檢測相關(guān)蛋白的變化。（3）Western blot法檢測用藥處理后NOTCH1下游癌基因c-Myc的表達(dá)以及熒光定量PCR法檢測c-Myc下游靶基因的水平。（4）RNA干擾技術(shù)沉默AURKB后，考察功能缺失的影響。（5）Western blot法檢測AZD1152是否在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)c-Myc。（6)Western blot法檢測AURKB是否能夠穩(wěn)定c-Myc。（7）蛋白質(zhì)免疫共沉

4、淀檢測AURKB是否能夠競爭性地和GSK3β與c-Myc結(jié)合。
　　結(jié)果：（1）AZD1152可以抑制T-ALL細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。（2）抑制AURKB可以引起c-Myc的降解。（3）抑制 AURKB可以下調(diào)c-Myc的下游靶基因。（4）體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)都證明AURK B能夠與c-Myc結(jié)合。（5）AURK B能夠顯著地穩(wěn)定c-Myc。（6）co-IP實(shí)驗(yàn)證明AURKB確實(shí)能夠阻斷GSK3β與c-Myc的結(jié)合引起的蛋白降解。

5、　　結(jié)論：研究表明AURKB抑制劑AZD1152具有抗T-ALL的作用，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)AURKB通過阻斷GSK3β與c-Myc結(jié)合，達(dá)到穩(wěn)定c-Myc蛋白的作用，抑制了AURKB的活性后，c-Myc能夠被降解。這項(xiàng)研究提示了AURKB抑制劑有可能成為治療T-ALL的藥物，為T-ALL患者帶來幫助。
　　第二部分：天然小分子化合物NMHC通過激活NOTCH信號通路抑制急性髓系細(xì)胞白血病細(xì)胞（AML）增殖的體內(nèi)外研究。
　　目的：

6、急性髓性細(xì)胞白血?。ˋML）主要表現(xiàn)為骨髓中造血干細(xì)胞的惡性增殖，是一種較常見的血液惡性腫瘤疾病。近年來，AML的治療雖有較大的進(jìn)展，但是大多數(shù)患者仍然死于耐藥，復(fù)發(fā)或并發(fā)癥。因此，臨床急需更有效的治療藥物。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，NOTCH信號通路在AML中發(fā)揮腫瘤抑制的作用。我們的前期實(shí)驗(yàn)表明NMHC能夠激活NOTCH而表現(xiàn)出顯著的抗AML作用，但是機(jī)制尚不明確。所以NMHC有可能為將來有效治療AML提供新的治療思路。
　　方法：（1）表

7、達(dá)譜基因芯片分析NMHC處理的 AML細(xì)胞與對照組比基因的富集情況。（2）蛋白質(zhì)印跡法（western blot）檢測NMHC處理AML細(xì)胞后NOTCH1的剪切情況。（3）計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)（Molsoft ICM method）對 NMHC的結(jié)構(gòu)與NOTCH1的所有結(jié)構(gòu)分別進(jìn)行模擬。（4）流式分析檢測抑制AML中的NOTCH信號通路后 NMHC誘導(dǎo) AML的細(xì)胞凋亡變化。（5）裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)評價(jià)藥物的體內(nèi)作用。
　　結(jié)果：（1）NM

8、HC處理AML細(xì)胞后，NOTCH信號通路相關(guān)基因，AML相關(guān)基因，凋亡相關(guān)基因被富集；（2）NMHC處理促進(jìn)了NOTCH1跨膜受體的剪切；（3）NMHC能夠進(jìn)入NOTCH1的負(fù)調(diào)控區(qū)NRR的疏水口袋中，可能促使S2切割位點(diǎn)更易被切割，NOTCH1更易被激活。（4）NOTCH1被抑制后，NMHC誘導(dǎo)的AML細(xì)胞凋亡明顯減少。（5）NMHC明顯減弱AML異源移植小鼠的負(fù)荷。
　　結(jié)論：體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究證明天然小分子化合物NMHC通過促進(jìn)