Notch信號(hào)通路在脈絡(luò)膜新生血管發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf

1、【研究背景】
　　新生血管生成是眼內(nèi)新生血管疾病，如年齡相關(guān)性黃斑變性（age related macular degeneration，AMD）、增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變（proliferative diabetic retinopathy，PDR）、視網(wǎng)膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion，RVO）及早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（retinopathy of prematurity，ROP）等眼病共有的病理改變和重要臨床

2、表現(xiàn)，其相伴隨的滲出、出血和纖維化等一系列病理改變可嚴(yán)重破壞眼的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致患者不同程度的視力障礙。在其發(fā)生機(jī)制中，多種誘發(fā)因素參與對(duì)眼底視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的破壞，組織發(fā)生過多的反應(yīng)性修復(fù)，在組織學(xué)中呈現(xiàn)視網(wǎng)膜前、視網(wǎng)膜內(nèi)或視網(wǎng)膜下新生血管生長的病理改變。
　　在多種類型的眼內(nèi)新生血管中，脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization,CNV）是來自脈絡(luò)膜毛細(xì)血管網(wǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過Bruch膜的裂口

3、遷移和增生，生長于Bruch膜與視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）之間、或神經(jīng)視網(wǎng)膜與RPE之間、或位于RPE與脈絡(luò)膜之間的新生血管叢。包括變性、遺傳、炎癥、腫瘤和外傷等多種因素均可造成RPE-Bruch膜-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體的損害，因而常伴發(fā)有CNV的生成。其中，繼發(fā)于AMD的CNV較多見于黃斑部，嚴(yán)重地?fù)p害中心視力，已成為老年人致盲的主要原因之一。CNV的發(fā)生機(jī)制尚不十分明確，但眾多研究

4、已證實(shí)多種細(xì)胞、生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）共同構(gòu)成CNV局部的微環(huán)境，并通過細(xì)胞、因子及信號(hào)通路之間的交互作用對(duì)CNV的生成發(fā)揮重要調(diào)控作用。因而，深入的機(jī)制研究為CNV的臨床治療開拓了新的方向。目前靶向血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的制劑已經(jīng)通過美國FDA認(rèn)證，而臨床研究發(fā)現(xiàn)其治療可有效地抑制新生血管生成，且有利于改善視力

5、。然而，VEGF同時(shí)具有維持血管正常通透和機(jī)能及神經(jīng)保護(hù)的功能，長期反復(fù)使用抗VEGF藥物，其安全性和療效的穩(wěn)定性有待進(jìn)一步觀察研究。更重要的是，在CNV的微環(huán)境中并不僅僅只有VEGF參與CNV的生成，單一抗VEGF治療可能并不足以達(dá)到理想治療效果，因而，深入研究CNV微環(huán)境中的其他重要因子，并探討其治療潛能，可為靶向治療CNV提供新的突破口。
　　Notch信號(hào)通路在無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物進(jìn)化過程中高度保守而廣泛存在于各組織。最近

6、研究表明，Notch信號(hào)通路中多種配體和受體在血管系統(tǒng)中表達(dá)，對(duì)胚胎及成年個(gè)體的生理性和病理性血管新生發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。值得一提的是，在胚胎期因基因單倍劑量缺失造成血管異構(gòu)而最終致死的研究中，目前發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的只有兩個(gè)基因，即Notch信號(hào)通路中的配體分子Delta like 4（Dll4）和VEGF，這提示Notch信號(hào)在對(duì)血管的調(diào)控中可能和VEGF具有著同等重要的地位。但不同于VEGF對(duì)血管生長進(jìn)行的遠(yuǎn)位調(diào)節(jié)，目前多認(rèn)為Notch信

7、號(hào)通過膜配體和膜受體的接觸發(fā)生細(xì)胞間的信號(hào)傳遞，從而調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞及其他相關(guān)細(xì)胞的活化和功能。最近兩年來，Notch信號(hào)在眼底視網(wǎng)膜血管發(fā)育及某些眼內(nèi)新生血管疾病中的重要作用被發(fā)現(xiàn)并重視，但Notch信號(hào)通路是否參與CNV的生成，且其是否具有治療CNV的潛能等諸多問題有待研究。
　　【目的】
　　觀察Notch信號(hào)通路對(duì)眼部及全身血管穩(wěn)態(tài)的維持作用，研究Notch信號(hào)通路對(duì)CNV生長及相關(guān)重要細(xì)胞的調(diào)控作用，從新的

8、角度探討Notch信號(hào)通路通過骨髓來源細(xì)胞（bone marrow derived cells，BMC）參與CNV生長的調(diào)控作用，進(jìn)一步探尋Notch信號(hào)通路對(duì)CNV的潛在治療可能，為CNV治療策略的拓展提供新的理論依據(jù)。
　　【方法】
　　1、建立誘導(dǎo)性基因敲除小鼠。交配繁育RBP-Jflox/WT、Mx-Cre和ROSA小鼠，得到Mx-Cre-RBP-Jflox/WT小鼠、Mx-Cre-RBP-Jflox/flox小鼠和

9、Mx-Cre-RBP-Jflox-ROSA小鼠，小鼠于出生后4周開始以500μg總劑量的poly:I-C誘導(dǎo)（以腹腔注射的方式分5次間隔進(jìn)行）；
　　2、采用組織病理學(xué)等技術(shù)，觀察RBP-J/Notch信號(hào)敲除后，小鼠眼部及全身其他臟器的血管變化以及皮下接種Matrigel膠內(nèi)的血管生長情況；
　　3、利用532nm激光建立小鼠CNV模型，通過熒光素眼底血管造影（fundus fluorescein angiography，

10、FFA）和組織病理學(xué)技術(shù)，觀察RBP-J/Notch信號(hào)敲除小鼠上CNV及接受RBP-J/Notch信號(hào)敲除小鼠骨髓移植的嵌合體小鼠上CNV的嚴(yán)重程度；
　　4、利用體外原代培養(yǎng)RBP-J/Notch信號(hào)敲除小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell，EPC），研究Notch信號(hào)缺失對(duì)相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　5、分別利用-secretase抑制劑

11、GSI體外阻斷和外源性給予Dll1融合蛋白體外激活培養(yǎng)人RPE細(xì)胞和胚胎來源彌猴視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞系RF/6A中的Notch信號(hào)通路，觀察Notch信號(hào)對(duì)CNV中重要細(xì)胞的生物學(xué)行為的調(diào)控。
　　6、對(duì)出生后乳鼠于天齡4d（P4）皮下注射血管靶向型Dll1-RGD融合蛋白，并對(duì)激光誘導(dǎo)CNV的野生型小鼠于激光誘導(dǎo)后1天行尾靜脈注射Dll1-RGD融合蛋白，觀察外源性血管靶向增強(qiáng)Notch信號(hào)的激活對(duì)視網(wǎng)膜血管發(fā)育和CNV生長的

12、作用。
　　【結(jié)果】
　　1、通過繁育RBP-Jflox/WT和Mx-Cre小鼠，獲得了Mx-Cre-RBP-Jflox/WT和Mx-Cre-RBP-Jflox/flox小鼠；通過繁育ROSA和Mx-Cre-RBP-Jflox小鼠交配，獲得了Mx-Cre-RBP-Jflox-ROSA小鼠。Mx-Cre-RBP-Jflox/WT小鼠、Mx-Cre-RBP-Jflox/flox小鼠和Mx-Cre-RBP-Jflox-ROSA小鼠

13、經(jīng)poly:I-C誘導(dǎo)后，對(duì)Mx-Cre-RBP-Jflox-ROSA小鼠耳部皮膚及視網(wǎng)膜血管行X-gal染色可見明顯藍(lán)染，表明小鼠血管開始高效表達(dá)Cre重組酶。Cre重組酶表達(dá)的同時(shí)可通過DNA重組敲除RBP-J/Notch信號(hào)，最終得到RBP-J(-/-)小鼠，即基因敲除小鼠（KO）和RBP-J(+/-)小鼠，即為基因部分存在的對(duì)照小鼠（CON）。
　　通過對(duì)KO小鼠和CON小鼠眼部及全身血管的觀察，本研究結(jié)果顯示RBP-J/

14、Notch信號(hào)缺失時(shí)，小鼠眼部（角膜、虹膜和視網(wǎng)膜）及全身其他器官（肝臟和肺臟）的血管穩(wěn)態(tài)的破壞，出現(xiàn)大量自發(fā)性新生血管。在小鼠皮下接種Matrigel膠5天后，KO小鼠皮下接種的膠內(nèi)長入大量新生血管并誘發(fā)出血。體外培養(yǎng)的KO小鼠的主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，體外KO小鼠的肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成中血管萌枝增多。分子水平檢測結(jié)果顯示KO小鼠內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGFR2表達(dá)上調(diào)，VEGFR1表達(dá)下調(diào)，且細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p21WAF1/CIP

15、1轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)下調(diào)。
　　2、對(duì)RBP-J基因敲除小鼠（KO）及對(duì)照小鼠（CON）上建立激光誘導(dǎo)的CNV，結(jié)果顯示Notch信號(hào)缺失時(shí)，F(xiàn)FA顯示新生血管的滲漏程度加重，且生成率增加，而組織病理學(xué)統(tǒng)計(jì)CNV厚度和面積均大于對(duì)照組小鼠。在研究Notch信號(hào)對(duì)于CNV相關(guān)細(xì)胞的作用中，使用-secretase抑制劑GSI阻斷細(xì)胞內(nèi)的Notch信號(hào)，細(xì)胞免疫組化和劃痕實(shí)驗(yàn)中可見到體外培養(yǎng)RPE細(xì)胞的增殖和遷移減弱；而RF/6A增殖能力增

16、強(qiáng)，但管腔形成能力減弱。
　　3、通過骨髓移植成功建立接受KO及CON小鼠骨髓的嵌合體小鼠，并建立激光誘導(dǎo)的CNV，可見到接受KO小鼠骨髓移植的嵌合體小鼠CNV生成加重。KO及CON小鼠骨髓經(jīng)Dio染色后移植到野生型小鼠體內(nèi)，對(duì)獲得的嵌合體小鼠建立的激光誘導(dǎo)CNV，可見CNV區(qū)域有綠色熒光細(xì)胞的浸潤，且細(xì)胞上表達(dá)基質(zhì)衍生因子受體（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4）。接受KO小鼠骨髓移植的小

17、鼠CNV區(qū)域的綠色熒光細(xì)胞數(shù)量減少。流式細(xì)胞技術(shù)檢測提示外周血EPC數(shù)量沒有明顯變化，而循環(huán)血中成熟的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯增加。通過原代培養(yǎng)小鼠的EPC，Transwell小室實(shí)驗(yàn)可見KO小鼠的EPC對(duì)基質(zhì)衍生因子（stroma derived factor-1，SDF-1）的趨化能力減弱，EPC上CXCR4的表達(dá)下調(diào)。
　　4、P5及P15天新生小鼠的視網(wǎng)膜血管上，Notch信號(hào)的激活分別集中在頂端細(xì)胞和血管分叉處，而在野生型小鼠的

18、激光誘導(dǎo)CNV區(qū)域，可見活化的Notch信號(hào)胞內(nèi)段（Notch intracellular domain，NICD）的表達(dá)上調(diào)。接受Dll1-RGD融合蛋白注射的乳鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育明顯較對(duì)照鼠遲緩，表現(xiàn)為血管分枝減少，血管內(nèi)頂端細(xì)胞數(shù)量減少。在接受Dll1-RGD注射的激光誘導(dǎo)CNV小鼠模型中，脈絡(luò)膜鋪片顯示其CNV的最大面積明顯小于對(duì)照鼠。體外實(shí)驗(yàn)中，可見到RF/6A侵襲能力減弱，而管腔形成能力增強(qiáng)，而RPE細(xì)胞的遷移能力減弱。

19、>　　【結(jié)論】
　　本研究證實(shí)，Notch信號(hào)在CNV的生成中發(fā)揮重要作用，Notch信號(hào)的缺失可加重CNV的生成，而外源性激活Notch信號(hào)對(duì)CNV的生成具有抑制作用。在成年個(gè)體中，Notch信號(hào)參與全身及眼部血管穩(wěn)態(tài)的維持，信號(hào)的缺失導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力加強(qiáng)及頂端細(xì)胞數(shù)量增加，這可能與Notch信號(hào)在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控VEGFR2、VEGFR1以及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p21WAF1/CIP1有關(guān)。
　　BMC同樣參與了CNV

20、的生成，其中EPC被認(rèn)為可在CNV生長中發(fā)揮重要作用。KO小鼠外周血循環(huán)中的EPC數(shù)量未發(fā)生明顯變化，而循環(huán)中內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量顯著增加；Notch信號(hào)缺失時(shí)，EPC對(duì)SDF-1的趨化作用反應(yīng)性降低，其原因可能是由于Notch信號(hào)缺失導(dǎo)致EPC上SDF-1受體CXCR4的表達(dá)下調(diào)。另外，Notch信號(hào)同時(shí)參與對(duì)RPE細(xì)胞的生物學(xué)行為的調(diào)控，可能通過影響RPE的增殖和遷移參與到CNV的消退期中。但是需要注意的是，由于我們使用的是Notch信號(hào)

21、全身性基因敲除小鼠，信號(hào)缺失后是否除內(nèi)皮細(xì)胞、BMCs和RPE細(xì)胞外其他細(xì)胞也因信號(hào)缺失參與CNV，這需要進(jìn)一步研究。
　　基于RBP-J/Notch信號(hào)的缺失導(dǎo)致CNV的加重，我們利用一種新型的融合蛋白Dll1-RGD以血管靶向性激活血管內(nèi)皮細(xì)胞中的Notch信號(hào)通路，可見到Dll1-RGD全身性給藥抑制小鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育及CNV的生成，這提示增強(qiáng)Notch通路的激活可能起到治療作用，但相關(guān)分子機(jī)制和長期注射是否具有毒性作用仍需