Dll4-Notch信號通路在脈絡膜新生血管生成中的作用機制研究.pdf

1、研究背景：
　　脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV），包括血管發(fā)生和血管生成過程，是多種可造成嚴重不可逆視力喪失的視網膜疾病的共同病理基礎。在近幾十年的努力中，對于CNV的病理生理機制和防治策略的研究已經取得了不少成績。然而，CNV的發(fā)展是一個非常復雜的動態(tài)過程。對于其發(fā)生發(fā)展的具體機制仍然知之甚少。
　　Delta樣配體4（Delta-like ligand 4，Dll4）是N

2、otch信號系統(tǒng)家族在哺乳動物細胞中的配體之一，特異性的表達于生理性和病理性的血管系。值得注意的是，小鼠基因敲除的研究中發(fā)現(xiàn)，單一Dll4等位基因缺失便會由于血管系統(tǒng)的發(fā)育障礙而導致小鼠胚胎期死亡。到目前為止，已知的僅有兩個血管發(fā)育相關基因，Dll4和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），具有半劑量等位基因致死效應，表明其在血管發(fā)生及生成過程中發(fā)揮著關鍵作用。
　　以往

3、的研究中發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導因子1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）對于調控視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞的功能非常重要，參與RPE細胞在受到多種來自于視網膜、Bruch’s膜及脈絡膜毛細血管微環(huán)境中如缺氧等刺激因素的影響后誘導CNV發(fā)生的起始過程。缺氧環(huán)境下，RPE細胞可通過HIF-1α-VEGF通路信號介導，影響脈絡膜微血管內皮細胞（choroidal

4、microvascular endothelial cells，CECs）的功能，從而調控CNV的發(fā)生發(fā)展。而已有研究報道發(fā)現(xiàn)，Dll4屬于缺氧調控基因，在內皮細胞（endothelial cells，ECs）功能中，它不僅可以直接受到HIF-1的信號誘導，同時也可接受HIF-1-VEGF通路信號調節(jié)。
　　結合這些研究結果，我們推測，在視網膜脈絡膜疾病的病理變化中，Dll4/Notch信號可能參與HIF-1α-VEGF信號途徑調

5、節(jié)CNV的血管生成。并且，我們課題組的研究已首次證實，Notch信號參與到CNV的調控，其信號的缺失將導致小鼠的激光誘導CNV模型發(fā)生更為嚴重的新生血管生成。然而，對于Dll4/Notch信號在CNV中調控作用的具體機制目前還尚未見報道。
　　目的：
　　本研究擬觀察環(huán)境缺氧刺激下Dll4在眼內細胞的表達情況，探討Dll4在參與調控CNV生成過程中與HIF-1α-VEGF信號通路間的關系，并應用共培養(yǎng)體系，模擬體內環(huán)境狀態(tài)下

6、RPE細胞與CECs之間的關系，以觀察Dll4在缺氧條件下RPE細胞誘導CECs功能變化過程中發(fā)揮的具體作用。
　　方法：
　　1．在本研究中，為了便于實驗操作及相關研究，我們選擇了與人CECs高度同源的恒河猴脈絡膜視網膜微血管內皮細胞系——RF/6A細胞用來進行實驗研究。對于體外培養(yǎng)的RF/6A細胞和RPE細胞進行CoCl2誘導的化學缺氧刺激，并建立RPE-RF/6A接觸/非接觸共培養(yǎng)體系以探討Dll4參與HIF-1α-V

7、EGF通路途徑影響CNV調控的具體作用。
　　2．應用實時定量PCR和Western blotting方法，分析Dll4、VEGF以及HIF-1α在缺氧的RF/6A細胞中的表達變化。通過shRNA干擾、免疫熒光染色法分析幾個因子之間的相互作用關系。對RF/6A細胞進行體外轉染，通過轉染表達全長Dll4的質?；虬邢駾ll4的siRNA形成Dll4不同表達水平的內皮細胞系。此外，應用Notch通路抑制劑γ分泌酶抑制劑（gamma se

8、cretase inhibitor，GSI）阻斷整個Notch通路信號。然后用不同Dll4/Notch通路信號水平的RF/6A細胞與RPE細胞在缺氧條件下共培養(yǎng)，觀察由RPE誘導的RF/6A細胞功能改變情況。
　　3．另外，通過免疫熒光染色檢測了Dll4在RPE細胞中的表達，并利用實時定量PCR和Western blotting檢測方法，分析了RPE細胞中Dll4在化學缺氧刺激下的表達變化。同時，通過體外轉染技術改變RPE細胞中的

9、Dll4表達水平，觀察其對RPE細胞增殖、遷移和侵襲等功能的影響。
　　結果：
　　1．研究顯示RF/6A細胞中Dll4的mRNA和蛋白表達水平在CoCl2誘導的化學缺氧條件下顯著上調，呈時間依賴性改變，并且這種上調變化受到HIF-1α以及VEGF的信號介導。共培養(yǎng)體系的結果表明，在缺氧的RPE細胞誘導條件下，提高RF/6A的Dll4表達水平使得細胞增殖能力和血管形成能力增強，但侵襲能力減弱。siRNA抑制細胞中Dll4的表

10、達后則使細胞功能呈現(xiàn)相反的改變。藥物性阻斷劑GSI完全阻斷Notch通路信號后對RF/6A細胞功能產生的作用與單純抑制Dll4的作用一致，但不完全相同。接觸共培養(yǎng)體系中觀察到Dll4具有抑制RF/6A細胞穿透RPE細胞單層的作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)VEGFR1、VEGFR2、EphrinB2和EphB4，幾個關鍵的CNV調控相關因子，在組成性過表達Dll4的RF/6A細胞中表達發(fā)生顯著性改變，為RF/6A細胞行為學的變化提供了機制分析。<

11、br>　　2．另外，對于Dll4在RPE細胞中的初步研究發(fā)現(xiàn)：RPE細胞中存在Dll4的表達，缺氧誘導刺激下，RPE細胞中Dll4的mRNA和蛋白表達增加呈時間依賴性改變。應用體外轉染技術改變RPE細胞中Dll4的表達水平以及藥物性阻斷Notch通路信號后發(fā)現(xiàn)，Dll4對RPE細胞的增殖具有促進作用，但對移行和侵襲呈現(xiàn)抑制作用。此外，接觸RPE-RF/6A共培養(yǎng)體系中觀察到，在RPE細胞中組成性過表達Dll4將阻礙RF/6A細胞穿過RP