miR-99a在兒童急性髓性白血病和慢性粒細(xì)胞性白血病的表達(dá)和功能研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼短鏈RNA，長度為19～25個(gè)核苷酸，可在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，其主要功能是miRNA與靶基因3′端非翻譯區(qū)(3′Untranslated region，3′-UTR)結(jié)合，并通過降解靶基因或者抑制靶基因翻譯來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人類miRNA有700多個(gè)左右，調(diào)控基因組中大約1/3的蛋白編碼基因，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等一系列重要生命過程。近來

2、研究表明，大約有50％已注釋的miRNA位于和癌癥相關(guān)的基因脆性位點(diǎn)及基因組區(qū)域中，在癌癥中起著原癌基因或者抑癌基因的作用，而且在許多惡性腫瘤包括白血病中已經(jīng)鑒定出與疾病的診斷、發(fā)展、治療反應(yīng)及預(yù)后相關(guān)的miRNA表達(dá)譜，本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表的前期研究工作亦支持這些結(jié)果。白血病在我國兒童的惡性腫瘤中發(fā)病率最高，而且兒童與成人白血病在生物學(xué)特性、治療反應(yīng)和預(yù)后等方面有明顯的不同。然而，目前許多實(shí)驗(yàn)都基于對成人白血病的研究，而對兒童白血病相關(guān)mi

3、RNA的研究較少，很多與兒童急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)和慢性粒細(xì)胞性白血病(chronicmyelogenous leukemia，CML)相關(guān)的miRNA未被鑒定。因此，很有必要專門發(fā)掘和分析與兒童白血病相關(guān)的miRNA，并對其作用和機(jī)制進(jìn)行深入研究，從非蛋白編碼基因的分子水平闡明兒童白血病的本質(zhì)。
　　 本研究收集了68例兒童AML和12例兒童特發(fā)性血小板減少性紫癜(作為對照組)的

4、骨髓樣本，其中18例兒童初發(fā)AML和5例對照組樣本用miRNA芯片技術(shù)分析miRNA表達(dá)譜，50例兒童AML和7例對照組樣本用qRT-PCR方法進(jìn)一步驗(yàn)證miR-99a的表達(dá)并分析其功能。另外，亦收集了12例兒童CML骨髓樣本用qRT-PCR方法研究miR-99a的表達(dá)并分析其功能。結(jié)果如下：
　　 (1)miRNA芯片揭示兒童初發(fā)AML存在特異性的miRNA表達(dá)譜。對18例兒童初發(fā)AML和5例對照組樣本的576個(gè)人類成熟miR

5、NA的表達(dá)譜進(jìn)行分析，篩選并獲得了在兒童初發(fā)AML中特異高表達(dá)的miRNA是miR-99a、miR-100、miR-125b、miR-335和miR-146a等，其中miR-99a的表達(dá)在兒童和成人白血病患者中均未見報(bào)道。
　　 (2)qRT-PCR技術(shù)印證miRNA芯片所顯示的miR-99a在兒童初發(fā)AML中高表達(dá)，并揭示其在不同疾病階段表達(dá)水平不同。qRT-PCR技術(shù)顯示miR-99a在所有兒童初發(fā)AML中高表達(dá)，與基因芯片

6、結(jié)果一致，而在91％AML CR患者中miR-99a的表達(dá)量下降，幾乎與對照組的表達(dá)相同，在可評估的復(fù)發(fā)患者中(AML-M2)，miR-99a的表達(dá)水平再次升高。同時(shí)qRT-PCR技術(shù)還顯示miR-99a在所有兒童初發(fā)CML患者中顯著高表達(dá)，而在CR患者中表達(dá)量下降。這些結(jié)果高度提示miR-99a起原癌基因的作用，促進(jìn)兒童AML和CML的發(fā)生和發(fā)展。
　　 (3)miR-99a通過調(diào)控靶基因CTDSPL和TRIB2發(fā)揮原癌基因功

7、能。為研究miR-99a的功能，構(gòu)建了miR-99a的載體，再通過生物信息學(xué)方法，運(yùn)用TargetScan(http∶//www.targetscan.org/)和PICTAR(pictar.mdc-berlin.de/)生物學(xué)軟件對miR-99a的靶基因進(jìn)行正向和反向預(yù)測，并結(jié)合文獻(xiàn)檢索，預(yù)測出可能與白血病細(xì)胞分化與凋亡相關(guān)的5個(gè)靶基因：TRIB2、CTDSPL、Hoxal、RAC-1、MCL-1。并構(gòu)建靶基因載體，在293T細(xì)胞中通

8、過雙熒光報(bào)告Lipo轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)先后篩選并初步證實(shí)其中的兩個(gè)抑癌基因CTDSPL和TRIB2是miR-99a靶基因。然后再選擇其中的CTDSPL進(jìn)行驗(yàn)證，在K562細(xì)胞(CML細(xì)胞系)中通過雙熒光報(bào)告電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與雙熒光報(bào)告Lipo轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)相符。
　　 (4)對36例兒童AML和3例對照組樣本進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果表明在對照組和58％的CR患者中CTDSPL蛋白表達(dá)較高，而在復(fù)發(fā)和53％的初發(fā)AML患者中CTDS

9、PL蛋白表達(dá)較低，與miR-99a的表達(dá)呈相反趨勢。此外，用100nM miR-99a mimics轉(zhuǎn)染K562和HL60細(xì)胞后CTDSPL的表達(dá)明顯降低。進(jìn)一步證實(shí)CTDSPL蛋白的表達(dá)受miR-99a調(diào)控，抑癌基因CTDSPL是miR-99a的靶標(biāo)之一，大部分患者的發(fā)病可能與之有關(guān)。
　　 (5)MTT實(shí)驗(yàn)表明miR-99a明顯促進(jìn)K562和HL60細(xì)胞的增殖。雙染凋亡實(shí)驗(yàn)也提示miR-99a抑制K562和HL60細(xì)胞的凋亡

10、。這些結(jié)果再次有力揭示miR-99a在兒童AML和CML中起著原癌基因的作用，促進(jìn)兒童AML和CML的發(fā)生和發(fā)展。
　　 綜上所述，通過研究miR-99a與兒童AML和CML的關(guān)系，首次證實(shí)了miR-99a在兒童AML和CML中起著原癌基因的作用，抑癌基因CTDSPL和TRIB2是受其調(diào)控的其中兩個(gè)靶基因。該研究從基因調(diào)控水平揭示了兒童AML和CML的其中一個(gè)新致病機(jī)制，為將來開展以miRNA作為藥靶治療白血病的可能性增加了新的