活性氧介導的椪柑原生質體再生能力差異的機理研究.pdf

1、原生質體培養(yǎng)及體細胞雜交技術為柑橘遺傳育種工作開辟了一條新思路，它已成為柑橘砧木及接穗品種改良的重要手段。目前，柑橘原生質體主要由愈傷組織和葉片分離而來，但只有來于前者的原生質體能持續(xù)分裂并再生，而葉肉原生質體目前還不能單獨用于柑橘遺傳改良。迄今，這兩種類型原生質體再生能力差異的機制尚不清楚。已有研究表明，活性氧(ROS)引起的氧化脅迫可能是造成不可再生型原生質體再生難的原因，然而另一方面ROS作為信號分子，對原生質體再生具有重要的調控

2、作用，抑制其產生會導致原生質體不可分裂再生?；诖耍菊撐囊詶崭逃鷤M織和葉片為起始材料，采用熒光標記法分析了ROS在椪柑原生質體分離與培養(yǎng)中的動態(tài)變化，同時通過NADPH氧化酶特異性抑制劑DPI和過氧化物酶抑制劑NaN3處理探究了其ROS的來源;分析了NADPH氧化酶基因家族成員在椪柑原生質體分離培養(yǎng)過程中的表達情況，克隆了一個特異表達的NADPH氧化酶基因（Crrboh10）;構建了Crrboh10的過表達載體，通過農桿菌介導轉化法

3、獲得了轉基因愈傷組織，并測定了椪柑轉基因愈傷組織和非轉基因愈傷組織的可溶性蛋白含量和H2O2含量。主要研究結果如下:
　　1.選取椪柑愈傷組織與葉肉原生質體分離與培養(yǎng)過程中5個時間點:即酶解2小時、4小時、6小時，培養(yǎng)4天、8天的原生質體，進行ROS熒光探針染色并用共聚焦顯微鏡觀察檢測。結果表明，在愈傷組織原生質體培養(yǎng)階段，細胞膜上出現明顯的ROS信號，而葉肉原生質體中ROS信號無明顯差異;分離階段愈傷組織原生質體其ROS水平顯著

4、低于葉肉原生質體，但在培養(yǎng)階段顯著高于葉肉原生質體。
　　2.選取椪柑愈傷組織原生質體體分離與培養(yǎng)過程中4個時間點:即酶解2小時、培養(yǎng)4天、8天、12天的原生質體，進行DPI和NaN3處理。結果表明，兩種抑制劑處理均降低了原生質體分離與培養(yǎng)過程中的ROS水平，表明椪柑愈傷組織原生質體其活性氧產生源有NADPH氧化酶和過氧化物酶。
　　3.利用半定量RT-PCR方法分析了13個柑橘NADPH氧化酶基因在原生質體分離與培養(yǎng)過程中

5、的表達情況。結果表明，中共檢測到9個基因（Crrboh1、Crrboh2、Crrboh5-6、Crrboh8-9及Crrboh10-12）的表達，且變化趨勢有明顯差異;不表達的基因是Crrboh3、Crrboh4、Crrboh7、crrboh13。
　　4.克隆了椪柑Crrboh10基因，并對其進行表達分析。該基因全長2812 bp，開放閱讀框2748 bp，編碼915個氨基酸;該基因編碼的蛋白分子量為103.51 kD，理論等電

6、點為9.11。使用實時定量PCR分析Crrboh10基因在椪柑組織中表達情況，發(fā)現其在根、莖、葉、愈傷組織中均有表達，表達量由高到低依次為愈傷組織、葉、根、莖。
　　5.將椪柑Crrboh10基因導入植物雙元表達載體pMD1301上，構建了pMD1301-Rboh10超表達載體以及將其導入農桿菌EHA105。以椪柑愈傷組織為外植體，通過農桿菌介導法進行遺傳轉化，采用GUS組織化學染色和實時定量PCR技術對轉化材料進行鑒定，成功獲得