Smad-c-Jun氨基末端激酶與尿道下裂發(fā)生相關(guān)性和調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的:尿道下裂(hypospadias)是一種常見(jiàn)的泌尿生殖系統(tǒng)畸形，在不同種族，新生兒發(fā)病率大約在1/(200～300)，并呈逐年上升趨勢(shì)。目前手術(shù)矯治是其唯一的治療方法，但是，任何一種矯治方式均會(huì)伴有顯著的并發(fā)癥以及造成患兒可能的精神心理陰影。為此，本研究擬從尿道下裂患者和尿道下裂動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究?jī)蓚€(gè)方面來(lái)探討Smad和JNK信號(hào)與尿道下裂發(fā)生的相關(guān)性和調(diào)控機(jī)制;為進(jìn)一步防治尿道下裂奠定科學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.臨床研

2、究:收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院泌尿外科病房行尿道修復(fù)術(shù)尿道下裂患兒（32例）術(shù)中切除的包皮組織，分為輕中型尿道下裂組（16例），重型尿道下裂組（16例）。同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組:為我院泌尿外科門(mén)診行包皮環(huán)切術(shù)兒童（32例）術(shù)中切除的包皮組織，各組取材均為陰莖遠(yuǎn)端包皮組織，尿道下裂輕中型組、重型組與正常對(duì)照組年齡匹配。分別應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(q-PCR)、免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)免疫印跡法（western blotting）檢測(cè)各組包皮組

3、織中Smad和JNK信號(hào)的表達(dá)水平。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　1).建立尿道下裂動(dòng)物模型:SD孕鼠40只，完全隨機(jī)分成4組:大豆油對(duì)照組和鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯[di-(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP]低、中、高3個(gè)劑量組（分別為500，750和1000mg/kg bw/day）。在懷孕天數(shù)(gestation day, GD)第12～19天連續(xù)灌胃，對(duì)出生后(postnatal day,

4、PND)不同日齡(PND1/8/16/20/30)仔鼠進(jìn)行計(jì)數(shù)、稱(chēng)量體重和測(cè)量肛門(mén)生殖器距離（anogenital distance，AGD）;PND30測(cè)量陰莖長(zhǎng)度，判斷有無(wú)尿道下裂。
　　2).同樣的SD孕鼠20只，完全隨機(jī)分成2組:大豆油對(duì)照組和上一部分實(shí)驗(yàn)得知的適宜建模的DEHP灌胃劑量組，于孕鼠GD20日齡，行手術(shù)剖宮產(chǎn)取胎鼠，切取胎鼠陰莖組織，分別應(yīng)用q-PCR、免疫組織化學(xué)和western blotting方法檢測(cè)各

5、組陰莖組織中Smad和JNK信號(hào)的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.相對(duì)于正常對(duì)照包皮組織，尿道下裂患者包皮組織中Smad7、Smad3和Smad2 mRNA的表達(dá)分別升高97.0％，22.8％和59.9％;且均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05); JNK1 mRNA和JNK1/2磷酸化蛋白在輕中型和重型尿道下裂患者包皮組織中的表達(dá)較正常水平亦顯著增高（均P＜0.05），JNK2磷酸化蛋白水平在重型尿道下裂患者的表達(dá)顯著高于輕

6、中型患者(P＜0.05)。免疫組織化學(xué)分析顯示Smad7、磷酸化Smad2/3和磷酸化JNK1/2蛋白在尿道下裂包皮組織中表達(dá)均有增高趨勢(shì)，且主要分布于包皮下的間充質(zhì)細(xì)胞層。
　　2.與大豆油對(duì)照組相比，隨著DEHP暴露劑量增大，每窩產(chǎn)活仔數(shù)及雄性活仔數(shù)均有顯著減少(P＜0.05);母鼠孕期明顯延長(zhǎng)，難產(chǎn)、死胎數(shù)增加;仔鼠體重減輕、AGD、體重/AGD和陰莖長(zhǎng)度明顯縮短(P＜0.05)。DEHP低中高劑量組誘導(dǎo)出雄性仔鼠尿道下裂發(fā)

7、生率分別為10.7％，30.6％和37.0％，且可分類(lèi)出輕型、中型和重型尿道下裂大鼠類(lèi)型，其中重型尿道下裂在三個(gè)劑量組的發(fā)生率分別為0％，8.3％和22.2％，各劑量組間差異顯著(P＜0.05);得出較適宜的DEHP誘導(dǎo)建模劑量為750 mg/kg bw/day。
　　3.DEHP孕期暴露后，胎鼠體重、AGD及其比值較正常大豆油對(duì)照明顯減輕或縮短(P＜0.05);胎鼠陰莖組織中Smad7、Smad3和Smad2mRNA表達(dá)較正常對(duì)

8、照組分別升高87.0％、61.9％和30.7％，均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Smad7和p-Smad2/3蛋白在DEHP暴露后胎鼠陰莖組織中表達(dá)豐富，而在正常對(duì)照組無(wú)表達(dá)。DEHP暴露組胎鼠陰莖組織中JNK1/2 mRNA和p-JNK1/2蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照顯著上調(diào)(P＜0.05)，但是T-JNK蛋白在兩組之間的表達(dá)水平無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:DEHP孕期暴露誘導(dǎo)出大鼠類(lèi)似于人類(lèi)的尿道下裂發(fā)生。S