Hes1基因與原發(fā)性肝癌發(fā)生相關(guān)性的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(Primary Hepatocellular Carcinoma，PHC)是全世界最常見(jiàn)的腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因。它具有發(fā)病隱匿、惡性病變快、惡性程度高、死亡率高和術(shù)后早期復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)。超過(guò)80％的原發(fā)性肝癌死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。在中國(guó)，肝癌是第二大癌癥致死疾病。因此，肝癌的防治工作任重道遠(yuǎn)。目前，其確切的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。只有對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制進(jìn)行深入研究，才能有效的防治肝癌。
　

2、　 Notch信號(hào)通路是在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的一條信號(hào)通路，廣泛地存在于無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的多個(gè)物種之中，Notch信號(hào)通路是介導(dǎo)細(xì)胞之間直接接觸的主要信號(hào)通路之一，主要參與調(diào)控多細(xì)胞機(jī)體的增殖、凋亡和分化?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Notch受體和信號(hào)通路在人類某些癌癥中異常表達(dá)，如結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、宮頸癌、腎癌和一些淋巴系統(tǒng)的腫瘤等。因此，Notch信號(hào)通路被認(rèn)為可以是潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。
　　 當(dāng)前研究表明，Hes1(hai

3、ry enhancer of split1)基因的表達(dá)受到跨膜蛋白Notch的調(diào)控，該調(diào)控過(guò)程被稱為Notch-hes1信號(hào)通路。Notch與相鄰細(xì)胞表面的配體結(jié)合后被激活，其胞內(nèi)亞基NICD(the intracellular domain of Notch)從細(xì)胞膜上脫離，然后通過(guò)自身的核定位信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核中，NICD與DNA結(jié)合蛋白R(shí)BP-J相結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄激活因子。該因子結(jié)合到Hes1的啟動(dòng)子上，誘導(dǎo)其表達(dá)。已有研究表

4、明，Hes1基因在維持機(jī)體各種前體細(xì)胞的未分化狀態(tài)中起重要作用，它可以保持未分化細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)細(xì)胞分化方向及命運(yùn)選擇的作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，Hes1基因還可以負(fù)調(diào)控干細(xì)胞的不對(duì)稱有絲分裂，維持其自我更新的能力。另外，研究也發(fā)現(xiàn)在某些腫瘤，包括橫紋肌肉瘤、骨骼肌肉瘤、膠質(zhì)瘤中，Hes1基因呈現(xiàn)異常表達(dá)，提示Hes1基因與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展存在相關(guān)性。本研究的目的就在于揭示Hes1的表達(dá)與原發(fā)性肝癌發(fā)生之間的相關(guān)性。
　　 采用RT-P

5、CR和Western blot的方法，我們分別在RNA水平和蛋白水平檢測(cè)了小鼠肝癌細(xì)胞系Hep1-6、H22中Hes1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Hes1基因在小鼠肝癌細(xì)胞中呈現(xiàn)出顯著高表達(dá)的特點(diǎn)。提示Hes1基因的高表達(dá)可能與原發(fā)性肝癌的發(fā)生存在相關(guān)性。因此，本研究首先通過(guò)構(gòu)建Hes1基因的shRNA慢病毒載體，篩選獲得Hes1基因穩(wěn)定沉默的肝癌細(xì)胞系Hep1-6-sh-Hes1。通過(guò)比較基因沉默前后肝癌細(xì)胞系在體外增殖特性以及體內(nèi)成瘤能力等生物

6、學(xué)特性的變化，揭示Hes1與原發(fā)性肝癌發(fā)生的密切關(guān)系。
　　 通過(guò)細(xì)胞增殖曲線、克隆形成能力以及細(xì)胞增殖相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定，我們發(fā)現(xiàn)Hes1基因沉默后，肝癌細(xì)胞株Hep1-6的增殖受到明顯抑制。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Hes1基因沉默后，肝癌細(xì)胞的侵襲能力降低。通過(guò)PI染色，我們觀察了Hes1沉默的Hep1-6肝癌細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程。結(jié)果表明Hes1沉默的肝癌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期G1期的阻滯，而且細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)了也發(fā)生相應(yīng)的

7、變化，如CDK2，CDK4和CDK6的表達(dá)降低，p21和p53的表達(dá)升高。這些結(jié)果提示在某種程度上，沉默Hes1的表達(dá)可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。另外，荷瘤實(shí)驗(yàn)表明，Hes1沉默的Hep1-6細(xì)胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)的成瘤能力明顯降低，提示Hes1的表達(dá)升高可能是體內(nèi)腫瘤發(fā)生的必要因素之一。這些研究結(jié)果提示了Hes1與肝癌發(fā)生的密切關(guān)系。為了進(jìn)一步證實(shí)這種相關(guān)性，我們對(duì)5例人原發(fā)性肝癌的臨床樣本進(jìn)行分析

8、，發(fā)現(xiàn)Hes1基因在原發(fā)性肝癌中呈現(xiàn)出高表達(dá)的特性，與上述小鼠相關(guān)的體內(nèi)外研究結(jié)果具有一致性，這為進(jìn)一步深入研究Hes1基因在肝癌發(fā)生中的作用機(jī)制，為原發(fā)性肝癌的新的診斷和治療方法的建立提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 本研究首次發(fā)現(xiàn)了原發(fā)性肝癌中Hes1基因呈現(xiàn)高表達(dá)的特征，并通過(guò)RNA干擾Hes1基因的表達(dá)，成功建立了Hes1基因穩(wěn)定沉默的細(xì)胞株，它可以作為研究Notch-Hes1信號(hào)通路及其與原發(fā)性肝癌關(guān)系的細(xì)胞模型。本研究初步探討