BDNF及其前體蛋白在炎性痛中的調控作用研究.pdf

1、第一部分炎性痛致大鼠脊髓后角及背根節(jié)ProBDNF及其受體的表達變化
　　目的:
　　探討完全弗氏佐劑(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)致炎性疼痛后大鼠脊髓后角和背根節(jié)(Dorsal root ganglion,DRG)內ProBDNF及其受體P75NrR和Sortilin的表達變化及意義。
　　方法:
　　大鼠隨機分為正常對照組和實驗組,實驗組大鼠左側足底皮下注射CFA和生理鹽水混

2、合溶劑100μl,建立炎性疼痛模型,實驗組分為注射CFA后1d、7d和14d組。在建模前和建模后1h、6h及1d、3d、7d和14d采用Von Frey纖維檢測大鼠50％機械縮足閾值(paw withdrawal threshold,PWT)的變化;采用免疫組織化學及westem blot方法觀察不同時間點ProBDNF及P75NrR、Sortilin在脊髓后角及DRG的表達變化。
　　結果:
　　1.足底注射CFA1h后5

3、0％PWT即下降,并在6h至1d左右達到最低值,3d后逐漸上調,至14d仍低于基礎值。
　　2.足底注射CFA1d后,注射側脊髓后角ProBDNF表達較對側明顯上調,這種上調持續(xù)至注射CFA后7d,CFA注射14d后,脊髓后角ProBDNF表達逐漸下降,但仍高于正常組,兩側表達差異不明顯。脊髓的western blot結果顯示,ProBDNF表達的明顯增高出現在炎性痛的后期即CFA7d時,且注射側表達明顯強于對側。DRG的免疫組化

4、和western blot結果表明,注射CFA后1d即可導致注射側DRG內ProBDNF的表達上調,注射側表達強于對側。與注射CFA1d比,注射CFA后7d時ProBDNF的表達進一步上調,且DRG內表達ProBDNF小直徑神經元數量逐漸減少,中、大直徑神經元數量明顯增多。至注射CFA后14 d,DRG內ProBDNF的表達下調。
　　3.脊髓內P75NTR的免疫組化和westem blot結果表明,足底注射CFA1d時,P75N

5、TR在脊髓后角的表達達高峰,兩側表達差異不明顯;至CFA7d,脊髓內P75NTR的表達仍較強。注射CFA14d時P75NTR的表達較7d明顯下降。DRG內P75TMTR的免疫組化和Western blot結果顯示,在炎性痛早期即CFA1d時,P75TMTR的表達即明顯增高,且兩側表達差異無顯著性;持續(xù)至CFA7d時,P75NTR的表達仍明顯增高,與CFA1d組比差異不明顯,至注射CFA14d時P75NTR的表達下降。
　　4.So

6、rtilin在正常脊髓后角淺層僅有較弱陽性產物表達,注射CFA后不同時間點脊髓內Sortilin的表達與正常對照組比差異不明顯。DRG內Sortilin的表達量在炎性痛后不同時間點也無顯著變化,但注射側DRG內表達Sortilin的小直徑神經元數量減少,中直徑神經元數量增多,這與proBDNF的表達模式類似。
　　結論:
　　足底注射CFA能誘導大鼠產生為期2周以上的炎性痛病程;炎性痛時脊髓后角和DRG內ProBDNF及P7

7、5NTR的表達上調可能參與了外周痛覺信號的傳導和中樞敏化的形成。DRG內表達Sortilin的細胞類型變換可能與proBDNF及BDNF的運輸及釋放有關。
　　第二部分炎性痛致大鼠脊髓及背根節(jié)內BDNF基因不同外顯子的表達變化
　　目的:
　　探討完全弗氏佐劑(Complete Freund’s Adiuvant,CFA)致炎性疼痛后大鼠脊髓和DRG內BDNF總的mRNA及包含不同BDNF外顯子mRNA的表達變化及意義

8、,從而揭示炎性痛不同時期、不同部位BDNF基因表達調節(jié)的差異性機制。
　　方法:
　　大鼠隨機分為正常組和實驗組,實驗組大鼠左側足底皮下注射CFA和生理鹽水混合溶劑100μl,建立炎性疼痛模型,實驗組包括注射CFA后1 d、7d和14d組。采用普通PCR以及Realtime-PCR方法檢測BDNF總的mRNA及BDNF不同外顯子(exonⅠ,exonⅡA,exonⅡB,exonⅡC,exonⅢ,exonⅣ和exonⅨA)在脊

9、髓和DRG內的表達變化。
　　結果:
　　1.足底注射CFA1d后,注射側脊髓內BDNF總的mRNA的表達明顯升高,注射側強于對側;上調持續(xù)至注射CFA后7d左右達高峰,對側表達也有增高,但注射側表達仍強于對側;至14d時,BDNFmRNA表達下調,但仍強于正常對照組。注射側DRG內BDNF mRNA的表達在注射CFA1d后明顯升高,注射側強于對側;上調持續(xù)至注射CFA后7d;至14d時,BDNF mRNA表達下調,與正常對

10、照組相比差異沒有顯著性。
　　2.足底注射CFA1d時,exonⅠ在注射側脊髓的表達明顯上調,與對側相比有明顯差異;exonⅡA和exonⅨA在對側脊髓表達有上調。至注射CFA7d時,注射側exonⅡA、exonⅡB和exonⅨA的表達較1d時明顯增高,并明顯高于對側。注射CFA14d時,脊髓兩側exonⅡB的表達仍高于正常組,對側脊髓內exonⅡA和exonⅨA的表達有上調。
　　3.足底注射CFA1d時,注射側DRG內B

11、DNF基因exonⅠ、exonⅡA、exonⅡB和exonⅣ的表達明顯上調,與對側相比有明顯差異。至注射CFA7d時,exonⅠ的表達較CFA1d時進一步增高,且明顯高于對側,其他外顯子的表達無明顯變化。至注射CFA后14d時,各外顯子的表達與正常對照組比差異均不明顯。
　　結論:
　　在炎性痛的不同時期、不同部位BDNF外顯子出現差異性的表達變化,BDNF外顯子的變化與總的BDNF mRNA的變化趨勢基本相符。
　　

12、第三部分炎性痛致大鼠脊髓后角乙酰化組蛋白3的表達變化及嗎啡的干預影響
　　目的:
　　探討完全弗氏佐劑(Cornplete Freund’s Adiuvant,CFA)致大鼠炎性疼痛后脊髓后角乙?；M蛋白3(Acetylated Histone 3,ACH3)水平的表達變化及意義,進一步說明組蛋白乙?；谘仔蕴弁串a生和發(fā)展過程中發(fā)揮的作用以及嗎啡干預對其的影響。
　　方法:
　　大鼠左側足底皮下注射CFA和生理鹽

13、水混合溶劑100μl,建立炎性疼痛模型。大鼠隨機分為正常組和實驗組(注射CFA后1d、7d組),后部分實驗增加CFA1 d+嗎啡干預組。采用免疫組織化學和免疫熒光化學方法觀察不同組脊髓后角AC}13的表達變化以及ACH3與神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞的雙標情況;采用Von Frey纖維檢測嗎啡對炎性痛早期大鼠50％PWT的變化,并觀察嗎啡干預對炎性痛早期脊髓后角ACH3及BDNF表達的影響。
　　結果:
　　1.免疫組織

14、化學結果顯示,注射CFA后1d,脊髓后角ACH3的表達明顯下調,與正常大鼠相比差異顯著;至注射CFA后7d,ACH3表達水平逐漸恢復。免疫熒光雙標結果表明,正常大鼠脊髓后角ACH3的表達主要在神經元,部分在膠質細胞。注射CFA1d后,ACH3的下調主要發(fā)生在神經元;而至CFA7d時表達ACH3的神經元數量明顯增加,且表達ACH3的星形膠質細胞和小膠質細胞數量也增加。
　　2.腹腔注射嗎啡(10mg/kg)可明顯增高大鼠CFA1 d

15、時的50％PWT。嗎啡可抑制炎性痛早期脊髓后角ACH3的下調,其作用在于增加了表達ACH3的神經元及膠質細胞的數量,尤其是星形膠質細胞和小膠質細胞。
　　3.正常大鼠脊髓后角可見較弱BDNF表達,注射CFA1d后注射側脊髓后角BDNF的表達明顯上調,且注射側表達強于對側;嗎啡干預對脊髓后角BDNF的表達無明顯影響。
　　結論:
　　CFA誘導的炎性痛可導致脊髓后角短暫的ACH3下調,這種下調可被嗎啡逆轉。在炎性痛的發(fā)生