BDNF及其前體蛋白在炎性痛中的調(diào)控作用研究.pdf

1、第一部分炎性痛致大鼠脊髓后角及背根節(jié)ProBDNF及其受體的表達(dá)變化
　　目的:
　　探討完全弗氏佐劑(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)致炎性疼痛后大鼠脊髓后角和背根節(jié)(Dorsal root ganglion,DRG)內(nèi)ProBDNF及其受體P75NrR和Sortilin的表達(dá)變化及意義。
　　方法:
　　大鼠隨機(jī)分為正常對照組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組大鼠左側(cè)足底皮下注射CFA和生理鹽水混

2、合溶劑100μl,建立炎性疼痛模型,實(shí)驗(yàn)組分為注射CFA后1d、7d和14d組。在建模前和建模后1h、6h及1d、3d、7d和14d采用Von Frey纖維檢測大鼠50％機(jī)械縮足閾值(paw withdrawal threshold,PWT)的變化;采用免疫組織化學(xué)及westem blot方法觀察不同時間點(diǎn)ProBDNF及P75NrR、Sortilin在脊髓后角及DRG的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.足底注射CFA1h后5

3、0％PWT即下降,并在6h至1d左右達(dá)到最低值,3d后逐漸上調(diào),至14d仍低于基礎(chǔ)值。
　　2.足底注射CFA1d后,注射側(cè)脊髓后角ProBDNF表達(dá)較對側(cè)明顯上調(diào),這種上調(diào)持續(xù)至注射CFA后7d,CFA注射14d后,脊髓后角ProBDNF表達(dá)逐漸下降,但仍高于正常組,兩側(cè)表達(dá)差異不明顯。脊髓的western blot結(jié)果顯示,ProBDNF表達(dá)的明顯增高出現(xiàn)在炎性痛的后期即CFA7d時,且注射側(cè)表達(dá)明顯強(qiáng)于對側(cè)。DRG的免疫組化

4、和western blot結(jié)果表明,注射CFA后1d即可導(dǎo)致注射側(cè)DRG內(nèi)ProBDNF的表達(dá)上調(diào),注射側(cè)表達(dá)強(qiáng)于對側(cè)。與注射CFA1d比,注射CFA后7d時ProBDNF的表達(dá)進(jìn)一步上調(diào),且DRG內(nèi)表達(dá)ProBDNF小直徑神經(jīng)元數(shù)量逐漸減少,中、大直徑神經(jīng)元數(shù)量明顯增多。至注射CFA后14 d,DRG內(nèi)ProBDNF的表達(dá)下調(diào)。
　　3.脊髓內(nèi)P75NTR的免疫組化和westem blot結(jié)果表明,足底注射CFA1d時,P75N

5、TR在脊髓后角的表達(dá)達(dá)高峰,兩側(cè)表達(dá)差異不明顯;至CFA7d,脊髓內(nèi)P75NTR的表達(dá)仍較強(qiáng)。注射CFA14d時P75NTR的表達(dá)較7d明顯下降。DRG內(nèi)P75TMTR的免疫組化和Western blot結(jié)果顯示,在炎性痛早期即CFA1d時,P75TMTR的表達(dá)即明顯增高,且兩側(cè)表達(dá)差異無顯著性;持續(xù)至CFA7d時,P75NTR的表達(dá)仍明顯增高,與CFA1d組比差異不明顯,至注射CFA14d時P75NTR的表達(dá)下降。
　　4.So

6、rtilin在正常脊髓后角淺層僅有較弱陽性產(chǎn)物表達(dá),注射CFA后不同時間點(diǎn)脊髓內(nèi)Sortilin的表達(dá)與正常對照組比差異不明顯。DRG內(nèi)Sortilin的表達(dá)量在炎性痛后不同時間點(diǎn)也無顯著變化,但注射側(cè)DRG內(nèi)表達(dá)Sortilin的小直徑神經(jīng)元數(shù)量減少,中直徑神經(jīng)元數(shù)量增多,這與proBDNF的表達(dá)模式類似。
　　結(jié)論:
　　足底注射CFA能誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生為期2周以上的炎性痛病程;炎性痛時脊髓后角和DRG內(nèi)ProBDNF及P7

7、5NTR的表達(dá)上調(diào)可能參與了外周痛覺信號的傳導(dǎo)和中樞敏化的形成。DRG內(nèi)表達(dá)Sortilin的細(xì)胞類型變換可能與proBDNF及BDNF的運(yùn)輸及釋放有關(guān)。
　　第二部分炎性痛致大鼠脊髓及背根節(jié)內(nèi)BDNF基因不同外顯子的表達(dá)變化
　　目的:
　　探討完全弗氏佐劑(Complete Freund’s Adiuvant,CFA)致炎性疼痛后大鼠脊髓和DRG內(nèi)BDNF總的mRNA及包含不同BDNF外顯子mRNA的表達(dá)變化及意義

8、,從而揭示炎性痛不同時期、不同部位BDNF基因表達(dá)調(diào)節(jié)的差異性機(jī)制。
　　方法:
　　大鼠隨機(jī)分為正常組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組大鼠左側(cè)足底皮下注射CFA和生理鹽水混合溶劑100μl,建立炎性疼痛模型,實(shí)驗(yàn)組包括注射CFA后1 d、7d和14d組。采用普通PCR以及Realtime-PCR方法檢測BDNF總的mRNA及BDNF不同外顯子(exonⅠ,exonⅡA,exonⅡB,exonⅡC,exonⅢ,exonⅣ和exonⅨA)在脊

9、髓和DRG內(nèi)的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.足底注射CFA1d后,注射側(cè)脊髓內(nèi)BDNF總的mRNA的表達(dá)明顯升高,注射側(cè)強(qiáng)于對側(cè);上調(diào)持續(xù)至注射CFA后7d左右達(dá)高峰,對側(cè)表達(dá)也有增高,但注射側(cè)表達(dá)仍強(qiáng)于對側(cè);至14d時,BDNFmRNA表達(dá)下調(diào),但仍強(qiáng)于正常對照組。注射側(cè)DRG內(nèi)BDNF mRNA的表達(dá)在注射CFA1d后明顯升高,注射側(cè)強(qiáng)于對側(cè);上調(diào)持續(xù)至注射CFA后7d;至14d時,BDNF mRNA表達(dá)下調(diào),與正常對

10、照組相比差異沒有顯著性。
　　2.足底注射CFA1d時,exonⅠ在注射側(cè)脊髓的表達(dá)明顯上調(diào),與對側(cè)相比有明顯差異;exonⅡA和exonⅨA在對側(cè)脊髓表達(dá)有上調(diào)。至注射CFA7d時,注射側(cè)exonⅡA、exonⅡB和exonⅨA的表達(dá)較1d時明顯增高,并明顯高于對側(cè)。注射CFA14d時,脊髓兩側(cè)exonⅡB的表達(dá)仍高于正常組,對側(cè)脊髓內(nèi)exonⅡA和exonⅨA的表達(dá)有上調(diào)。
　　3.足底注射CFA1d時,注射側(cè)DRG內(nèi)B

11、DNF基因exonⅠ、exonⅡA、exonⅡB和exonⅣ的表達(dá)明顯上調(diào),與對側(cè)相比有明顯差異。至注射CFA7d時,exonⅠ的表達(dá)較CFA1d時進(jìn)一步增高,且明顯高于對側(cè),其他外顯子的表達(dá)無明顯變化。至注射CFA后14d時,各外顯子的表達(dá)與正常對照組比差異均不明顯。
　　結(jié)論:
　　在炎性痛的不同時期、不同部位BDNF外顯子出現(xiàn)差異性的表達(dá)變化,BDNF外顯子的變化與總的BDNF mRNA的變化趨勢基本相符。
　　

12、第三部分炎性痛致大鼠脊髓后角乙酰化組蛋白3的表達(dá)變化及嗎啡的干預(yù)影響
　　目的:
　　探討完全弗氏佐劑(Cornplete Freund’s Adiuvant,CFA)致大鼠炎性疼痛后脊髓后角乙?；M蛋白3(Acetylated Histone 3,ACH3)水平的表達(dá)變化及意義,進(jìn)一步說明組蛋白乙酰化在炎性疼痛產(chǎn)生和發(fā)展過程中發(fā)揮的作用以及嗎啡干預(yù)對其的影響。
　　方法:
　　大鼠左側(cè)足底皮下注射CFA和生理鹽

13、水混合溶劑100μl,建立炎性疼痛模型。大鼠隨機(jī)分為正常組和實(shí)驗(yàn)組(注射CFA后1d、7d組),后部分實(shí)驗(yàn)增加CFA1 d+嗎啡干預(yù)組。采用免疫組織化學(xué)和免疫熒光化學(xué)方法觀察不同組脊髓后角AC}13的表達(dá)變化以及ACH3與神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的雙標(biāo)情況;采用Von Frey纖維檢測嗎啡對炎性痛早期大鼠50％PWT的變化,并觀察嗎啡干預(yù)對炎性痛早期脊髓后角ACH3及BDNF表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.免疫組織

14、化學(xué)結(jié)果顯示,注射CFA后1d,脊髓后角ACH3的表達(dá)明顯下調(diào),與正常大鼠相比差異顯著;至注射CFA后7d,ACH3表達(dá)水平逐漸恢復(fù)。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果表明,正常大鼠脊髓后角ACH3的表達(dá)主要在神經(jīng)元,部分在膠質(zhì)細(xì)胞。注射CFA1d后,ACH3的下調(diào)主要發(fā)生在神經(jīng)元;而至CFA7d時表達(dá)ACH3的神經(jīng)元數(shù)量明顯增加,且表達(dá)ACH3的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量也增加。
　　2.腹腔注射嗎啡(10mg/kg)可明顯增高大鼠CFA1 d

15、時的50％PWT。嗎啡可抑制炎性痛早期脊髓后角ACH3的下調(diào),其作用在于增加了表達(dá)ACH3的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量,尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。
　　3.正常大鼠脊髓后角可見較弱BDNF表達(dá),注射CFA1d后注射側(cè)脊髓后角BDNF的表達(dá)明顯上調(diào),且注射側(cè)表達(dá)強(qiáng)于對側(cè);嗎啡干預(yù)對脊髓后角BDNF的表達(dá)無明顯影響。
　　結(jié)論:
　　CFA誘導(dǎo)的炎性痛可導(dǎo)致脊髓后角短暫的ACH3下調(diào),這種下調(diào)可被嗎啡逆轉(zhuǎn)。在炎性痛的發(fā)生