乙型肝炎病毒編碼蛋白對宿主炎性基因的調控作用及其機制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（HBV），為嗜肝DNA病毒科家族成員，能夠引起一系列疾病，包括自限性急性肝炎、暴發(fā)性肝炎、慢性肝炎、肝硬化以及肝細胞癌。慢性乙型肝炎病毒感染，仍然是一個嚴重危害健康的全球性疾病問題。據(jù)估計，目前全球約有四億人為慢性HBV感染者，我國是乙肝高發(fā)地區(qū)，其中1％的慢性乙肝發(fā)展為重型肝炎，預后差。HBV編碼病毒蛋白被認為在肝臟疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用，例如影響病毒的復制和調節(jié)宿主基因的表達等。本實驗室前期的結果證明：HBV編

2、碼HBc蛋白和HBx蛋白能夠通過MAPK信號途徑激活轉錄因子c-Ets-2，使其與人纖維介素基因fgl2啟動子上的順式作用元件特異性結合，進而激活該基因的轉錄調控。
　　 凋亡是人類肝臟疾病中最常見的肝細胞損傷機制。盡管有很多刺激和機制能夠引起凋亡，肝細胞卻特異性的對死亡受體引起的凋亡更易感。至少有三類腫瘤壞死因子（TNF）超家族成員參與介導HBV感染時肝細胞的凋亡過程，分別為TNF、Fas 配體（Fasl）和腫瘤壞死因子相關凋

3、亡誘導配體（TRAIL）。TRAIL為一類II 型跨膜蛋白，屬TNF超家族成員，通過與廣泛表達于靶細胞表面的TRAIL受體結合，繼而將凋亡信號傳遞給caspase，誘導靶細胞的凋亡，而對正常的細胞不發(fā)揮或發(fā)揮極微弱的作用。TRAIL在肝細胞死亡中的作用至今仍存在爭議，最初在動物模型中的研究認為與TNF和Fasl不同，TRAIL并不引起正常肝細胞的凋亡。然而，隨著研究的進一步開展發(fā)現(xiàn)，TRAIL能誘導病毒感染、脂肪酸浸潤后的肝細胞發(fā)生凋亡

4、。在HBV導致的肝臟損害中，TRAIL的表達明顯增強，其表達水平與肝臟損害程度呈顯著正相關，提示TRAIL參與了HBV導致的重型肝炎的發(fā)病機制。
　　 首先，設計進行了以下試驗來探討HBV編碼相關蛋白是否對人TRAIL基因具有激活作用。pcDNA-HBc、pcDNA-HBs和pcDNA-HBx分別為三種HBV編碼蛋白HBc、HBs和HBx的真核表達質粒，將上述質粒分別與hTRAIL啟動子熒光素酶報告基因質粒及pRL-TK海腎螢光

5、素酶對照報告基因質粒（pRL-TK）共轉染到HepG2肝癌細胞系。來研究HBV編碼的蛋白是否對hTRAIL基因具有激活作用；若有作用，是何種病毒蛋白發(fā)揮活化基因的作用。通過檢測報告基因相對熒光素酶（LUC）值反映病毒蛋白對hTRAIL啟動子的轉錄激活作用，結果顯示，HBx蛋白能激活hTRAIL基因啟動子的轉錄；采用實時熒光定量和Western Bloting結果顯示相對熒光素酶的結果提示：在HepG2細胞，轉染pcDNA-HBx組hTR

6、AIL基因的mRNA和蛋白表達水平均高于對照組。而HBc蛋白和HBs蛋白則不能激活該基因的表達。
　　 為研究HBV編碼HBx蛋白作用下，參與激活hTRAIL基因的順式作用元件及反式作用因子，我們進行了系列啟動子裁截缺失試驗，即構建了一系列5’端缺失而具有共同3’端的hTRAIL基因啟動子熒光素酶報告質粒，將其分別與HBV編碼HBx蛋白的真核表達質粒共轉染HepG2細胞。結果表明：在hTRAIL基因啟動子-89位至-29位（相對

7、于轉錄起始點）之間區(qū)域存在著重要的調控序列。為進一步探討該區(qū)域內是否存在轉錄因子結合位點，我們利用生物信息學軟件和數(shù)據(jù)庫進行了分析，結果提示有三個主要候選轉錄因子結合位點存在于hTRAIL基因啟動子的-89位至-29位之間。為了確定起決定作用的轉錄因子結合位點，我們采用Quick-Change定點突變方法，對hTRAIL基因啟動子熒光素酶報告基因質粒的這三個轉錄因子結合位點分別進行定點突變，酶切結果和測序結果證實三個位點均突變成功。在H

8、epG2肝癌細胞系將HBx真核表達質粒與突變后的hTRAIL啟動子熒光素酶報告基因質粒進行共轉染實驗，檢測熒光素酶值結果發(fā)現(xiàn)在HBx作用下，兩個sp1轉錄因子結合位點分別突變后質粒的相對熒光素酶活性降低50.1％和52.4％，而其他位點突變后相對熒光素酶活性沒有發(fā)生顯著性改變。凝膠遷移試驗表明，轉染病毒蛋白HBx真核表達質粒后，HepG2細胞核蛋白能與含有sp1的hTRAIL基因啟動子探針特異性結合，而且轉錄因子sp1的抗體能使該結合條

9、帶發(fā)生遷移，凝膠遷移實驗說明HBx蛋白能使轉錄因子sp1與hTRAIL基因啟動子上相應的順式作用元件位點發(fā)生特異性結合。用sp1抗體進行了染色質免疫共沉淀試驗來研究在乙型肝炎病毒蛋白HBx作用下與轉錄因子sp1結合的DNA序列是否存在于是hTRAIL基因啟動子上的順式作用元件。結果表明：在HBx蛋白作用下，以與轉錄因子sp1結合的DNA序列為模板進行PCR擴增，可擴增到長度為206bp的序列，該序列位于hTRAIL基因啟動子上，并包含-

10、89位至-29位（相對于轉錄起始點），進一步證實在乙型肝炎HBx病毒蛋白作用下，sp1是激活hTRAIL基因所必需的轉錄因子。為了檢測轉錄因子sp1在細胞內的表達情況，我們采用共聚焦顯微鏡技術進行檢測，結果顯示轉染了HBx真核表達質粒pcDNA-HBx后，在胞核及胞漿中均可見sp1蛋白的表達，與轉染空質粒對照組以、HBs及HBc真核表達質粒組相比，HBx組sp1蛋白的表達強度明顯增強。采用RNA干擾的方法對HepG2細胞中sp1的表達進

11、行干預實驗，結果顯示sp1表達的抑制可使hTRAIL啟動子熒光素酶的相對熒光素酶值降低64.8％，此結果進一步證實了轉錄因子sp1是病毒蛋白HBx激活hTRAIL基因所必需的重要作用因子。上述試驗結果表明，病毒蛋白HBx激活宿主hTRAIL基因的轉錄表達是通過活化轉錄因子sp1，后者發(fā)生核轉位，并與核內hTRAIL基因啟動子（-89位至-29位之間）上的相應順式作用元件特異性結合。
　　 以上結果說明，乙型肝炎病毒編碼HBx蛋白