Calpain在大鼠炎性疼痛模型中作用的研究.pdf

1、背景：外周組織炎性損傷可以產(chǎn)生對(duì)初級(jí)疼痛感受器和C纖維的持續(xù)刺激，導(dǎo)致脊髓傷害性神經(jīng)元的興奮性增強(qiáng)，進(jìn)而引起痛覺(jué)過(guò)敏和觸誘發(fā)痛。研究證實(shí)，轉(zhuǎn)錄因子NFkB是促炎細(xì)胞因子、粘附分子以及血管活性介質(zhì)等可誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的關(guān)鍵物質(zhì)，在炎癥病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，并且參與炎性疼痛的形成。同時(shí)，大部分通過(guò)抑制NFkB活性來(lái)抑制炎性反應(yīng)的物質(zhì)也顯示出抗傷害性反應(yīng)的效果。因而，尋找可以抑制NFkB活化的物質(zhì)成為治療炎性疼痛的方法之一。
　　

2、 Calpain是一種鈣離子依賴半胱氨酸蛋白酶，參與許多生理和病理過(guò)程。有研究顯示，Calpain可以降解NFkB抑制物IkBα的PEST序列，使NFkB活化入核，啟動(dòng)后續(xù)靶基因的轉(zhuǎn)錄。這提示Calpain可能通過(guò)降解IkBα使NFkB活化，進(jìn)而參與炎性疼痛的發(fā)生，而如果抑制Calpain活性則可能緩解炎性疼痛。因此，細(xì)致研究Calpain、IkBα、NFkB表達(dá)在炎性疼痛中的變化，以及它們之間的關(guān)系可以更加深入的理解炎性疼痛的發(fā)生機(jī)制

3、，以期發(fā)現(xiàn)更具針對(duì)性且更有效的疼痛治療靶點(diǎn)。
　　 目的：
　　 建立Zymosan足底炎性疼痛大鼠模型，采用行為學(xué)和Western blot方法，研究zymosan足底炎性疼痛模型大鼠制模后脊髓背角Calpain活化水平的變化，以及下游IkBα、胞核NFkB的表達(dá)變化。
　　 材料與方法：
　　 Sprague—Dawley大鼠48只，隨機(jī)分為3組，即正常對(duì)照組(n=8，48h行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后處死)、假

4、手術(shù)組(n=16，8只于制模后4h處死，8只繼續(xù)行為學(xué)測(cè)量)以及zymosan組(n=24，分別于制模后4h、24h、48h處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死8只)。按Meller方法通過(guò)在大鼠左側(cè)后足皮下注射zymosan1.25mg制作zymosan足底炎性疼痛模型，假手術(shù)組在左側(cè)后足皮下注射同等容積的PBS。采用Von Frey壓力測(cè)痛儀分別于制模后0.5h、1h、2h、4h、8h、24h和48h測(cè)定各組大鼠左側(cè)后足MWT，并使用電子數(shù)顯卡尺測(cè)

5、量左足最大厚度。各組大鼠在指定時(shí)間點(diǎn)處死后取制模側(cè)腰段脊髓背角，采用Western blot方法測(cè)定脊髓背角中Calpain降解底物spectfinαII的表達(dá)變化以判斷Calpain的活性，并測(cè)定下游IkBα和胞核NFkB表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.與對(duì)照組和假手術(shù)組相比，zymosan組大鼠制模后0.5h、1h、2h、4h、8h、24h和48h MWT均明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)，提示zymosa

6、n組大鼠出現(xiàn)炎性痛覺(jué)過(guò)敏。
　　 2.與對(duì)照組和假手術(shù)組相比，zymosan組大鼠制模后0.5h、1h、2h、4h、8h、24h和48h左足最大厚度均明顯增加(P＜0.01)，提示zymosan組大鼠出現(xiàn)炎性水腫。
　　 3.zymosan組大鼠制模后4h、24h和48h，制模側(cè)腰段脊髓背角spectrinαII降解產(chǎn)物表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，提示脊髓背角Calpain活化水平明顯增強(qiáng)。
　　 4.zymo

7、san組大鼠制模后4h、24h和48h，制模側(cè)脊髓背角IkBα表達(dá)明顯下降(P＜0.01)，胞核NFkB表達(dá)明顯增加(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.Zymosan足底炎性疼痛模型大鼠脊髓背角Calpain活化水平顯著增強(qiáng)，可能參與炎性疼痛的形成。
　　 2.脊髓背角Calpain活化后可能通過(guò)降解IkBα，活化NFkB，參與炎性疼痛的形成。
　　 第二部分 Calpain抑制劑ALLN對(duì)Zym

8、osan足底炎性疼痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用及其對(duì)脊髓背角COX—2表達(dá)水平的影響
　　 目的：
　　 Zymosan足底炎性疼痛模型大鼠腹腔注射Calpain抑制劑ALLN，觀察其鎮(zhèn)痛作用和對(duì)脊髓背角COX—2表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討Calpain在炎性疼痛中的作用機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 Sprague—Dawley大鼠64只，隨機(jī)分為3組，包括假手術(shù)組(n=16)、Z+V組(n=24，分別于制模后4

9、h、24h、48h處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死8只)和z+A組(n=24，分別于制模后4h、24h、48h處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死8只)。制模方法同第一部分。Z+A組大鼠在制模前30min腹腔注射Calpain抑制劑ALLN20mg/kg，Z+V組大鼠在制模前30min腹腔注射同體積的ALLN溶劑DMSO。通過(guò)Von Frey壓力測(cè)痛儀測(cè)定各組大鼠于制模后0.5h、1h、2h、4h、8h、24h和48h的MWT，觀察鎮(zhèn)痛效果；并使用電子數(shù)顯卡尺在相

10、同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量各組大鼠左足最大厚度。各組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死取制模側(cè)腰段脊髓背角，采用Western blot方法測(cè)定腰段脊髓背角中COX—2的含量變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.Z+V組大鼠疼痛仍持續(xù)存在，MWT與sham組大鼠相同時(shí)間點(diǎn)比較有顯著差異(P＜0.05，P＜0.01)。Z+A組大鼠制模后0.5h、1h、2h、4h、48h MWT雖仍顯著降低，與sham組大鼠相同時(shí)間點(diǎn)比較有顯著差異(P＜0.05，P＜0.0

11、1)；但8h和24h與sham組大鼠相同時(shí)間點(diǎn)比較，MWT無(wú)顯著差異；且4h、8h、24h、48h與Z+V組大鼠相同時(shí)間點(diǎn)比較，MWT明顯下降(P＜0.05)，提示疼痛明顯緩解。
　　 2.Z+V組大鼠制模后各時(shí)間點(diǎn)左足最大厚度仍顯著增加，與sham組大鼠相同時(shí)間點(diǎn)比較有顯著差異(P＜0.01)。Z+A組大鼠制模后各時(shí)間點(diǎn)左足最大厚度雖然仍顯著增加，與sham組大鼠相同時(shí)間點(diǎn)比較有顯著差異(P＜0.05，P＜0.01)；但制模后

12、4h、8h、24h、48h各時(shí)間點(diǎn)左足最大厚度與Z+V組大鼠相同時(shí)間點(diǎn)比較顯著減小(P＜0.05)，提示水腫明顯緩解。
　　 3.Z+V組大鼠制模后4h、24h、48h、Z+A組大鼠制模后4h與sham組相比，脊髓背角COX—2表達(dá)水平明顯增加(P＜0.01)；Z+A組大鼠制模后24h和48h與sham組比較脊髓背角COX-2表達(dá)水平無(wú)顯著差異；Z+A組大鼠制模后4h、24h和48h與Z+V組相同時(shí)間點(diǎn)比較，脊髓背角COX—2表