神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦外傷保護(hù)作用的研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷是神經(jīng)外科的常見(jiàn)病和多發(fā)病，國(guó)內(nèi)外神經(jīng)外科醫(yī)師一直致力于重型顱腦損傷的臨床治療和相關(guān)的基礎(chǔ)研究。神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞。過(guò)去認(rèn)為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem，CNS)損傷后神經(jīng)元或軸突不能再生。近年來(lái)研究證實(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在著具有多分化潛能和自我更新能力的NSCs，它們?cè)谝欢ǖ臈l件下能夠進(jìn)行增殖以及向特定的方向進(jìn)行

2、誘導(dǎo)分化；神經(jīng)元軸突具有再生潛力并能形成新的突觸聯(lián)系，這使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和神經(jīng)退行性疾病的NSCs的替代治療成為可能。雖然NSCs終身存在，但其絕對(duì)數(shù)量和受局部微環(huán)境所限，致使中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或變性時(shí)，自我修復(fù)作用微乎其微。近年來(lái)，對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(neurotrophin-3，NT-3)的研究發(fā)現(xiàn)，NT-3對(duì)NSCs具有促進(jìn)其分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的作用。另外，由于NSCs進(jìn)行活體移植后，較長(zhǎng)時(shí)間的存活和分化有一定的困難，研究發(fā)現(xiàn)

3、可能與微環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)因子缺乏有關(guān)。為此，我們主要就NSCs移植后加入NT-3，觀察NT-3對(duì)NSCs移植治療腦外傷的作用。 1建立SD大鼠胚胎端腦皮層NSCs的分離、培養(yǎng)、增殖、分化與鑒定技術(shù)觀察NSCs的生長(zhǎng)、增殖及分化特點(diǎn)。分離SD大鼠胚胎端腦皮質(zhì)，經(jīng)酶消化及機(jī)械吹打后，用懸浮培養(yǎng)的方法，獲得細(xì)胞克隆；用有限稀釋法進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，得到來(lái)源于同一細(xì)胞的亞細(xì)胞系克?。挥妹庖呒?xì)胞化學(xué)方法，鑒定NSCs。從SD大鼠胚胎端腦皮質(zhì)分離的細(xì)

4、胞，經(jīng)原代和傳代培養(yǎng)均可形成細(xì)胞克隆，并具有增殖能力：免疫細(xì)胞化學(xué)Nestin抗體染色陽(yáng)性；單細(xì)胞克隆能分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。用此方法分離的細(xì)胞具有自我更新和分化潛能、有很強(qiáng)的增殖能力，是屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞。 2建立SD胚胎大鼠端腦皮層NSCs的冷凍復(fù)蘇方法，觀察凍存復(fù)蘇后NSCs的活力及生物學(xué)特性。采用10％BSA+10％DMSO作冷凍保護(hù)劑，于超低溫冰箱(-150℃)中凍存；采用細(xì)胞培養(yǎng)和免疫細(xì)胞化

5、學(xué)方法觀察凍存復(fù)蘇后細(xì)胞的活力、形態(tài)、分化能力及特異性抗原表達(dá)。不同的凍存時(shí)間、細(xì)胞代數(shù)對(duì)凍存后細(xì)胞的存活率沒(méi)有明顯影響；凍存復(fù)蘇的NSCs不僅有較高的存活率，而且仍保持其原有的生物學(xué)特性。胚胎大鼠端腦皮層NSCs的短期凍存并不影響其活力及原有的生物學(xué)特性，可作為NSCs保存的一種較好途徑。 3研究NT-3對(duì)SD胚胎大鼠端腦皮層NSCs分化的影響。在NSCs培養(yǎng)液中分別加入NT-31ng/ml，5ng/ml和1ong/ml三個(gè)不

6、同劑量組，在CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察NSCs的生長(zhǎng)分化情況。含有NT-3的培養(yǎng)液NSCs主要分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞，可分化為少量的星形膠質(zhì)細(xì)胞，分別行NSE，GalC和GFAP染色為陽(yáng)性。NT-3主要促進(jìn)NSCs分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞，也可以分化為少量的星形膠質(zhì)細(xì)胞。 4主要觀察研究腦外傷后移植NSCs的治療作用以及同時(shí)給予NT-3，觀察NSCs在體內(nèi)的存活、分化、遷移情況。SD胚胎大鼠端腦皮層NSCs的體外培

7、養(yǎng)以及BrdU的轉(zhuǎn)染；腦外傷模型的建立；NSCs移植給腦外傷大鼠，同時(shí)NT-3試驗(yàn)組給予NT-31ng/ml，5ng/ml和1ong/ml，分別在1，2，3周后對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分，然后處死動(dòng)物，進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢查，以及HE染色、Nestin、GFAP、NSE、GalC、BrdU等免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Tunel原位雜交染色。在1，2，3周時(shí)神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分NSCs組和NT-3組均明顯比對(duì)照組得分低，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有差異；Nestin

8、、GFAP、NSE、GalC、BrdU抗體染色結(jié)果，NSCs組和NT-3組均明顯比對(duì)照組陽(yáng)性率要高，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有差異；而Tunel染色則對(duì)照組明顯比NSCs組和NT-3組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果對(duì)照組發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)也明顯比NSCs組和NT-3組高；NSCs組與NT-31ng/ml，5ng/ml和1ong/ml劑量組比較，Nestin、GFAP、NSE、GalC、BrdU抗體染色陽(yáng)性率要偏低，而Tunel染色和流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)

9、發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)要偏高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而且NT-31ong/ml劑量組的差異更明顯。腦外傷后移植NSCs后神經(jīng)干細(xì)胞可以在損傷區(qū)存活、增殖及分化，并且在損傷的遠(yuǎn)隔部位有少許NSCs遷移和分化。NT-3對(duì)NSCs的移植存活、增殖與分化均有明顯的促進(jìn)作用，而且主要使NSCs朝神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的方向分化，尤其以NT-31ong/ml劑量組作用最明顯。 結(jié)論1成功分離，培養(yǎng)的細(xì)胞具有自我更新和分化潛能，行免疫細(xì)胞化學(xué)Nestin、

10、NSE、GFAP和GalC抗體染色為陽(yáng)性，為SD大鼠胚胎端腦皮層NSCs。2對(duì)培養(yǎng)的不同代的SD大鼠胚胎端腦皮層NSCs進(jìn)行凍存，在不同的凍存時(shí)間進(jìn)行復(fù)蘇后，細(xì)胞的活力和生物學(xué)特性沒(méi)有明顯改變。3NT-3的1ng/ml,5ng/ml，1ong/ml三個(gè)劑量組均能夠使NSCs發(fā)生分化，其中分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量較多，而朝星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的相對(duì)較少，尤其以1ong/ml的作用最為明顯。4NSCs早期移植給受損傷的腦組織，NSCs在