MSCs移植對心肌梗死后心功能及心肺復蘇結(jié)果影響的實驗研究.pdf

1、主要研究內(nèi)容： 一．大鼠骨髓MSCs的生物學特性研究探討MSCs分離、培養(yǎng)、純化、擴增、鑒定、標記的方法，研究其生物學特性。 二．大鼠骨髓MSCs體外誘導分化為心肌細胞大鼠骨髓MSCs經(jīng)5-AZA處理后，在體外定向分化為心肌細胞，并用免疫組化的方法從蛋白水平對誘導后的MSCs進行心肌特異性蛋白表達進行鑒定，確定MSCs在體外能向心肌細胞轉(zhuǎn)化。 三．大鼠骨髓MSCs在體內(nèi)分化為有收縮／舒張性能的心肌細胞采用特殊的成

2、年大鼠心肌細胞的分離和培養(yǎng)技術(shù)，對左前降支冠狀動脈(Left anterior descemding coronary artery，LAD)結(jié)扎致心肌梗死后MSCs治療的大鼠進行單個心肌細胞的分離和培養(yǎng)，獲得由MSCs在體內(nèi)分化而來的成熟的心肌細胞，并利用IonOptixTM系統(tǒng)觀察其收縮力，對其心肌特異性蛋白desmin、α-sarcomeric actin、troponin I的表達情況進行免疫組化鑒定。 四．大鼠骨髓MS

3、Cs在心肌梗死和心肺復蘇模型中的應用觀察3種不同途徑的MSCs治療(靜脈內(nèi)、左心室內(nèi)、局部梗死心肌內(nèi))對大鼠心肌梗死后心功能的影響及其后CPR的影響，探討生存于心肌組織中的MSCs能否經(jīng)受住缺血和再灌注(心跳驟停及心肺復蘇)的打擊，并維持改善了的心功能，從而為MSCs治療心血管疾病提供強有力的實驗依據(jù)。 第一章大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)及其生物學特性研究心血管疾病的細胞治療需要足夠數(shù)量的干細胞。而骨髓中MSCs數(shù)量極少，僅占骨

4、髓細胞總量的0.001～0.01％。如何對這微量的細胞在體外進行分離純化、大量擴增，從而滿足實驗及臨床細胞治療所需要的數(shù)量，是本章的研究內(nèi)容。 研究目的: 建立骨髓MSCs的體外分離培養(yǎng)方法，研究MSCs的生物學特性，為進一步誘導分化和實驗應用奠定基礎(chǔ)。 材料與方法: 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，4±1周齡，在無菌條件下取骨髓，用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離純化MSCs，傳代擴增時控制胰酶消化時

5、間，在相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，并采用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD11b／c，CD29，CD44H，CD45，CD90.1表達。觀察熒光物質(zhì)PKH26標記細胞后的染色及生長情況。 小結(jié): 全骨髓貼壁培養(yǎng)法和消化控制相結(jié)合能有效地分離純化大鼠骨髓MSCs，MSCs在體外培養(yǎng)具有很強的擴增能力，第3代的細胞具有很高的純度又有很強的增殖分化能力，適用于誘導分化研究及細胞治療。 第二章　骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導分化

6、為心肌細胞及其鑒定　　MSCs能否分化為心肌細胞是MSCs用于心血管疾病治療的前提和基礎(chǔ)。本章的目的在于證實MSCs在合適的誘導劑的作用下，能在體外誘導分化為心肌細胞，并進行心肌細胞特異性抗體檢測。 研究目的: 探討5-AZA體外定向誘導大鼠骨髓MSCs分化為心肌細胞的潛能，并進行心肌細胞特異性抗體檢測，為MSCs移植治療心血管疾病的實驗及臨床應用奠定理論基礎(chǔ)。 材料與方法: 傳代培養(yǎng)的P3大鼠MSCs

7、以終濃度為10μmol／L的5-AZA誘導24h，然后按原培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察誘導細胞的形態(tài)改變，在誘導后2周時采用免疫組化染色檢測心肌特異性蛋白Desmin、α-sarcomeric actin、troponin I的表達情況。 小結(jié): 5-AZA能在體外誘導MSCs向心肌細胞分化，這為MSCs治療心血管疾病提供了理論基礎(chǔ)。 第三章　骨髓間充質(zhì)干細胞體內(nèi)分化為有收縮／舒張性能的心肌細胞及其生物學特性研究

8、　　骨髓MSCs在體外的誘導分化實驗已證實能向成體心肌細胞轉(zhuǎn)化，但在體內(nèi)是否真的能分化為心肌細胞包括搏動的心肌細胞仍然是目前MSCs移植研究中尚未明確的課題，以前在這方面的研究均是通過免疫組化的方法對心肌組織病理切片內(nèi)的MSCs進行心肌細胞特異性蛋白的鑒定，來明確所移植的MSCs在體內(nèi)是否向心肌樣細胞的轉(zhuǎn)化，但這些細胞是否能象正常的心肌細胞一樣具有收縮／舒張性能，科學界并沒有進行證實。本研究利用成年心肌細胞分離和培養(yǎng)的成熟經(jīng)驗，將PKH

9、26標記的MSCs注入梗死部位的心肌內(nèi)，6周后對治療后的心臟進行離體消化，獲得了由PKH26標記的MSCs分化而來的具有收縮／舒張性能的活的心肌細胞，為MSCs移植治療心血管疾病提供了關(guān)鍵的證據(jù)。研究目的采用特殊的成年大鼠心肌細胞的分離和培養(yǎng)技術(shù)，對冠狀動脈左前降支結(jié)扎致心肌梗死后MSCs治療的大鼠進行單個心肌細胞的分離和培養(yǎng)，獲得由MSCs在體內(nèi)分化而來的成熟的心肌細胞，并對其收縮力及心肌特異性蛋白desmin、α-sarcomeri

10、c actin、troponin I的表達情況進行鑒定。 材料與方法: LAD結(jié)扎1周后大鼠開胸并在梗死心肌內(nèi)局部注射5×106MSCs進行治療，注射后6周采用特殊的成年大鼠心肌細胞分離和培養(yǎng)技術(shù)對治療后的心臟進行單個心肌細胞的分離和培養(yǎng)。利用IonOptixTM系統(tǒng)，觀察和記錄了所獲得的由PKH26標記的MSCs分化而來的大鼠心肌細胞的長度及收縮／舒張功能，并用免疫組化的方法檢測由MSCs分化而來的心肌細胞的特異性抗原

11、表達。 小結(jié): 1.采用特殊的成年大鼠心肌細胞分離和培養(yǎng)技術(shù)能分離得到由PKH26標記的MSCs分化而來的心肌細胞。 2.PKH26標記的MSCs分化的心肌細胞具有與正常心肌細胞無異的收縮和舒張功能。 3.PKH26標記的MSCs分化的心肌細胞表達心肌特異性蛋白desmin、α-sarcomeric actin、troponin I。 第四章　骨髓間充質(zhì)干細胞在心肌梗死和心肺復蘇模型中的應用　　

12、利用細胞移植的方法來增加有功能的心肌細胞的數(shù)量，從而改善心功能已成為心血管疾病治療的新途徑。以前的心肺復蘇研究使用的均是健康的動物，且研究的重點放在復蘇后藥物的選擇及各種器械如何改進復蘇后血流動力學。但臨床實際情況是在CPR發(fā)生之前病人大多有嚴重的心臟疾病，因而本課題研究力圖盡量接近臨床實際，首先結(jié)扎LAD，造成較嚴重的心肌缺血，4周后注射MSCs或PBS，治療的干預措施提到了CPR之前，治療4周后再誘發(fā)心室顫動(Ventricular

13、 fibrillation，VF)及進行CPR，觀察MSCs治療對心肌梗死后心功能及其后的CPR的影響，從而為MSCs治療心肌梗死及改進CPR的結(jié)果提供實驗依據(jù)，同時，生存于缺血心肌中的MSCs能否經(jīng)受住第二次缺血缺氧的打擊并維持改善的心功能，也是我們研究的重點之一。 研究目的: 觀察MSCs對大鼠心肌梗死后心功能的影響及其后CPR的影響，從而為MSCs治療心血管疾病提供實驗依據(jù)。 材料與方法: 首先結(jié)扎

14、SD大鼠LAD，4周后通過靜脈、左心室內(nèi)、梗死心肌局部3種不同途徑注射PKH26標記的5 × 106SCs，注射后2周及4周觀察各組心功能改善情況，并在4周時誘導VF及CPR，觀察比較CPR時各組血流動力學的改變及復蘇后生存時間。 全文主要結(jié)論: 1.采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法和胰酶消化控制相結(jié)合的方法能有效純化分離大鼠骨髓MSCs。MSCs能在體外迅速擴增，生長性狀穩(wěn)定，體外培養(yǎng)骨髓MSCs可以滿足實驗研究及臨床細胞治療的需

15、要。PKH126具有很好的染色效果及安全性，是移植細胞體內(nèi)示蹤的較佳選擇。 2.大鼠骨髓MSCs在體外經(jīng)5-AZA誘導后可向心肌細胞轉(zhuǎn)化，誘導后的MSCs表達心肌特異性蛋白desmin、α-sarcomeric actin、troponin I。表明MSCs在一定的條件下可向心肌細胞轉(zhuǎn)化。 3.采用特殊的成年心肌細胞分離和培養(yǎng)的方法可分離得到PKH26標記的MSCs在體內(nèi)分化而成的搏動的心肌細胞，搏動幅度及心肌特異性蛋白

16、desmin、α-sarcomeric actin、troponin I表達與正常的心肌細胞無異。 4.大鼠心肌梗死后采用3種不同途徑(靜脈內(nèi)、左心室內(nèi)、局部梗死心肌內(nèi))MSCs注射治療，心功能同樣明顯改善。在CPR過程中及復蘇后4h的CI、dp／dt40、-dp／dt、LVDP結(jié)果及復蘇后的生存時間明顯優(yōu)于對照組。3種不同注射途徑治療后的心臟病理切片發(fā)現(xiàn)有大量的PKH26標記的細胞存在，局部心肌內(nèi)注射組的MSCs數(shù)量顯著高于靜