經(jīng)HIF-1α基因修飾的心臟干細(xì)胞移植對(duì)心肌梗死后心衰大鼠心功能的影響.pdf

1、目的：經(jīng)缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）基因修飾的心臟干細(xì)胞移植與單純心臟干細(xì)胞移植相比，對(duì)心衰大鼠心功能、心臟干細(xì)胞存活率、梗死區(qū)邊緣毛細(xì)血管、心肌細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：
　　1.心臟干細(xì)胞（cardiac stem cells，CSCs）培養(yǎng)：采用1日齡SD雄性大鼠進(jìn)行心臟干細(xì)胞分離鑒定與純化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)心臟干細(xì)胞。
　　2.基因重組腺病毒感染心臟干細(xì)

2、胞；采用RT-qPCR法檢測(cè)心臟干細(xì)胞HIF-1αmRNA表達(dá)。
　　3.模型制備及分組：將24只SD大鼠隨機(jī)等分為3組：缺氧誘導(dǎo)因子1α修飾的心臟干細(xì)胞組、單純心臟干細(xì)胞組和模型組，以開胸結(jié)扎冠脈前降支的方法制備心肌梗死后心衰模型，2周后分別注射經(jīng)基因修飾的心臟干細(xì)胞、單純心臟干細(xì)胞及PBS液。
　　4.觀察指標(biāo)：4周后進(jìn)行結(jié)果采集：超聲測(cè)定心功能；熒光顯微鏡下觀察CSCs存活情況并計(jì)算CSCs密度；HE染色法評(píng)估梗死邊緣

3、區(qū)心肌病理學(xué)改變；TUNEL法檢測(cè)梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡率；Western Blot法檢測(cè)梗死邊緣VEGF蛋白表達(dá)情況；免疫組化染色檢測(cè)CD31的表達(dá)，計(jì)算梗死邊緣區(qū)毛細(xì)血管密度；分析左心室射血分?jǐn)?shù)差值與心臟干細(xì)胞存活密度相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.原代培養(yǎng)的大鼠心臟組織塊7~8天后，圓形、體積小、折光性強(qiáng)的心臟干細(xì)胞開始從組織塊邊緣爬出；
　　2.通過抗c-kit抗體和鏈親和素-FITC標(biāo)記，在波長(zhǎng)490 nm可見

4、光激發(fā)后，可清晰見到被FITC顯影的c-kit+CSCs，經(jīng)流式細(xì)胞儀，c-kit+CSCs可被系統(tǒng)識(shí)別并收回，培養(yǎng)的細(xì)胞中CSCs純度為13％左右，繼續(xù)培養(yǎng)純化的CSCs至第3代；
　　3.重組腺病毒均可成功感染CSCs，感染后干細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，感染效率高，無毒副作用；經(jīng)測(cè)定MOI值為300時(shí)感染效率最佳；在HIF1α-EGFP+CSCs組(4.483±0.156)中HIF1α基因轉(zhuǎn)錄的mRNA量顯著高于在EGFP+CSCs組

5、(1.007±0.13)和CSCs組(1.18±0.03)(P<0.05)；
　　4.細(xì)胞移植4周后，各組間心功能指標(biāo)表現(xiàn)出顯著性差異：與模型組(31.51±4.34)相比， MI+CSCs+HIF1α組(43.99±4.95)和MI+CSCs組(39.41±3.72)的LVEF顯著升高，其中以 MI+CSCs+HIF1α組變化更為顯著(P<0.05)；
　　5.移植4周后，MI+CSCs+HIF1α組心臟干細(xì)胞存活率(12

6、.391±1.881)顯著高于MI+CSCs組(6.756±1.181)(P<0.05)；移植前后左心室射血分?jǐn)?shù)差值與梗死邊緣區(qū)CSCs存活率呈正相關(guān)(r=0.867， P<0.01)；
　　6.移植4周后，3組均可見凋亡細(xì)胞，MI+CSCs+HIF1α組細(xì)胞凋亡率(47.40±3.06)%和MI+CSCs組(53±3.65)%比較顯著降低(P<0.05)，而MI+CSCs組細(xì)胞凋亡率又明顯低于MI組(61.20±3.91)%(P

7、<0.05)；
　　7.術(shù)后4周 CSC+HIF1α+MI組(4.747±0.969)比 MI組(1.17±0.088) VEGF蛋白表達(dá)水平顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；MI+CSCs+HIF1α組毛細(xì)血管密度(12.82±0.86)顯著高于MI+CSCs組(8.86±1.08)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.HIF1α基因修飾的CSCs移植和單純CSCs移植均可減少心肌梗死大鼠心