兔抗人凝血因子ⅩⅢA亞單位多克隆抗體的制備、鑒定及應(yīng)用研究.pdf

1、本文研究目的：采用免疫動物方法制備FⅩⅢ A亞單位多克隆抗體，并對其進(jìn)行鑒定，檢測其特異性及活性，并將多克隆抗體應(yīng)用于FⅩⅢ缺乏的檢測和FⅩⅢ抗原表位分析，為進(jìn)一步研究FⅩⅢ抑制物作用機制奠定基礎(chǔ)。 研究方法： 1．免疫動物法制備多克隆抗體。 2．Dot blot鑒定抗體，抗體中和／尿素溶解實驗檢測多克隆抗體活性。 3．Western blot檢測FⅩⅢ缺乏及dot blot分析抗原表位。 研究結(jié)

2、果： 1．(1)以兔抗人FⅩⅢ抗血清孵育過夜的PVDF膜在純化的人FⅩⅢ、含轉(zhuǎn)氨酶活性位點多肽Ⅱ點樣處均出現(xiàn)陽性信號，而在含鈣離子結(jié)合位點多肽Ⅰ點樣處無陽性信號。 (2)正常血漿與兔血清(0ul，10ul，40ul，80ul)混合孵育，加入CaCl<,2>溶液后，4管均有血漿纖維蛋白凝塊形成，大小基本相同，再加入5M尿素溶液1h后，第1管纖維蛋白凝塊基本無變化，而第2，3，4管均有不同程度的縮小，且縮小的程度依抗血清量的

3、增加依次遞增。 2．(1)用純化的人FⅩⅢ蛋白、正常血漿電泳轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜上，當(dāng)用制備的抗血清作一抗、用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG作二抗，在82.5KD的位置均有陽性信號，而FⅩⅢ缺乏病例1血漿在82.5KD的位置處有較弱的陽性信號，F(xiàn)ⅩⅢ缺乏病例2血漿在82.5KD的位置處沒有陽性信號。 (2)以FⅩⅢ缺乏病例1血清孵育后，再加兔血清孵育過夜的PVDF膜在含轉(zhuǎn)氨酶活性位點多肽Ⅱ點樣處出現(xiàn)陽性信號；純化的人F

4、ⅩⅢ和含鈣離子結(jié)合位點多肽Ⅰ點樣處均無陽性信號。而以FⅩⅢ缺乏病例2血清孵育后，再加兔血清孵育過夜的PVDF膜在純化的FⅩⅢ、含鈣離子結(jié)合位點多肽Ⅰ、含轉(zhuǎn)氨酶活性位點多肽Ⅱ點樣處均未見陽性信號。 研究結(jié)論： 1.用免疫動物法成功制備了針對FⅩⅢA亞單位轉(zhuǎn)氨酶活性位點的兔抗人多克隆抗體，此抗體不僅可特異性與純化的人FⅩⅢ及含轉(zhuǎn)氨酶活性位點多肽結(jié)合，而且在體外可以抑制人FⅩⅢ活性。 2.應(yīng)用此抗體可檢測FⅩⅢ缺乏，且