硫酸軟骨素蛋白多糖在視覺(jué)發(fā)育可塑性關(guān)鍵期終止前后對(duì)大鼠視皮層神經(jīng)元興奮性回路的影響.pdf

1、弱視是一種眼科常見(jiàn)疾病,弱視患者占世界人口的2-5％,中國(guó)有1000多萬(wàn)弱視患者。弱視患者的矯正視力低于相同年齡正常人的視力,同時(shí)還有對(duì)比敏感度,立體視覺(jué),運(yùn)動(dòng)知覺(jué)等的損害。大量研究表明弱視主要的損害部位在視皮層,弱視的發(fā)生和治療與視覺(jué)發(fā)育可塑性關(guān)鍵期密切相關(guān),在視覺(jué)發(fā)育可塑性關(guān)鍵期內(nèi),如先天性白內(nèi)障或斜視等異常的視覺(jué)環(huán)境可以導(dǎo)致弱視,在可塑性關(guān)鍵期內(nèi)如果能及時(shí)地消除異常的視覺(jué)環(huán)境,弱視能治愈;在視覺(jué)發(fā)育可塑性關(guān)鍵期終止以后,異常的視覺(jué)

2、環(huán)境則不再能引起弱視,但弱視的治療效果明顯降低,在臨床上成年和大于12歲的弱視患者基本不能被治愈。因此,視覺(jué)發(fā)育可塑性關(guān)鍵期的終止與否對(duì)弱視治療效果具有非常重要的意義。
　　 人類和哺乳動(dòng)物出生后,視覺(jué)系統(tǒng)在外界環(huán)境刺激和內(nèi)在基因調(diào)控下,會(huì)發(fā)生形態(tài)和功能的適應(yīng)性變化,這種變化的最敏感時(shí)期稱為視覺(jué)發(fā)育可塑性關(guān)鍵期。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)對(duì)視覺(jué)發(fā)育可塑性關(guān)鍵期終止有重要影響的因素是:視皮層內(nèi)突觸可塑性、局部興奮性/抑制性神經(jīng)元回路的成熟、

3、神經(jīng)元細(xì)胞外基質(zhì)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及一些相關(guān)基因的表達(dá)。近年研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)中一些成分,如硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitinsulphate proteoglycan,CSPG)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育晚期逐漸濃縮在神經(jīng)元周圍,形成包圍神經(jīng)元胞體和樹(shù)突的神經(jīng)元周圍網(wǎng)絡(luò)(Perineuronal nets,PNNs)。大鼠視皮層內(nèi)CSPG形成PNNs的過(guò)程在視覺(jué)發(fā)育可塑性關(guān)鍵期后期,暗飼養(yǎng)能延遲大鼠視覺(jué)發(fā)育可塑性關(guān)鍵期的終止,也能導(dǎo)致視皮

4、層內(nèi)PNNs數(shù)目顯著減少,從而表明由CSPG形成的PNNs參與了視覺(jué)可塑性關(guān)鍵期的終止。大鼠視皮層內(nèi)興奮性突觸傳遞主要由NMDA受體和AMPA受體介導(dǎo),正常大鼠視覺(jué)發(fā)育可塑性關(guān)鍵期高峰后,NMDA受體電流在興奮性突觸后電流中所占比率降低,AMPA受體電流所占比率增加,暗飼養(yǎng)能延遲大鼠NMDA受體電流的發(fā)育性變化,提示興奮性突觸的發(fā)育變化可能也參與了大鼠視覺(jué)可塑性關(guān)鍵期的終止過(guò)程。這些研究結(jié)果雖然表明CSPG和興奮性突觸的發(fā)育都與大鼠視覺(jué)

5、發(fā)育可塑性關(guān)鍵期終止有關(guān),但它們參與關(guān)鍵期終止的具體機(jī)制仍不明確。
　　 本課題提出如下假說(shuō):在視覺(jué)發(fā)育可塑性關(guān)鍵期后期,視皮層內(nèi)CSPG逐漸發(fā)育成熟,形成PNNs包裹在神經(jīng)元胞體和樹(shù)突周圍,對(duì)神經(jīng)元的興奮性突觸后受體具有選擇性屏蔽作用。在可塑性關(guān)鍵期終止前后及成年階段,PNNs選擇性屏蔽NMDA受體,導(dǎo)致興奮性突觸傳遞中NMDA受體介導(dǎo)的成分逐漸降低,AMPA受體介導(dǎo)的成分逐漸增加,興奮性突觸的結(jié)構(gòu)和功能逐漸達(dá)到成年的穩(wěn)定狀態(tài)

6、,興奮性突觸可塑性水平降低,這些變化參與視皮層可塑性關(guān)鍵期終止過(guò)程。為了驗(yàn)證此假說(shuō),我們從以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究。
　　 第一部分研究:正常大鼠視皮層可塑性關(guān)鍵期終止前后興奮性突觸后電流的發(fā)育變化。通過(guò)膜片鉗技術(shù),我們研究了出生后3周到8周(P3W-P8W),正常大鼠視皮層谷氨酸能興奮性突觸后電流(Olutamatergic excitatory postsynaptic current,Glu-EPSC)及其兩種成分,NMDA受

7、體電流(NMDA receptor-mediated excitatory postsynaptic current,NMDA-EPSC)和AMPA受體電流(AMPA receptor-mediated excitatory postsynapticcurrent,AMPA-EPSC)的發(fā)育變化。這部分結(jié)果顯示:1.P3W-P8W正常大鼠視皮層神經(jīng)元Glu-EPSC幅值隨發(fā)育逐漸升高,P7W達(dá)峰值,P3W-P8W正常大鼠視皮層神經(jīng)元NM

8、DA-EPSC幅值隨發(fā)育變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P3W-P8W正常大鼠視皮層神經(jīng)元AMPA-EPSC幅值隨發(fā)育逐漸升高,P6W達(dá)峰值,P6W以后無(wú)顯著變化。2.NMDA-EPSC/Glu-EPSC比率隨發(fā)育降低,P6W時(shí)達(dá)到最小值,AMPA-EPSC/Glu-EPSC比率隨發(fā)育增加,P6W時(shí)達(dá)到最大值。這些結(jié)果提示發(fā)育過(guò)程中視皮層興奮性神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)受體亞型構(gòu)成比的變化是導(dǎo)致視皮層可塑性關(guān)鍵期終止的機(jī)制之一。
　　 第二部分研究:降解CS

9、PG對(duì)大鼠視皮層神經(jīng)元興奮性突觸后電流的影響。通過(guò)大鼠視皮層內(nèi)注射硫酸軟骨素酶(chondroitinaseABC,chABC)制作成CSPG降解大鼠模型,用膜片鉗技術(shù)記錄了P3W-P8WCSPG降解大鼠視皮層Glu-EPSC,NMDA-EPSC,AMPA-EPSC的發(fā)育變化,并與同期正常大鼠比較,結(jié)果顯示:1.P5W-P8WCSPG降解大鼠視皮層神經(jīng)元Glu-EPSC幅值顯著高于同期正常大鼠,P4W-P8WCSPG降解大鼠視皮層神經(jīng)元

10、NMDA-EPSC幅值顯著高于同期正常大鼠,P6W-P8WCSPG降解大鼠視皮層神經(jīng)元AMPA-EPSC幅值顯著高于同期正常大鼠。2.P6w-P8WCSPG降解大鼠視皮層神經(jīng)元NMDA-EPSC/Glu-EPSC比率顯著高于同期正常大鼠,P6W-P8WCSPG降解大鼠視皮層神經(jīng)元AMPA-EPSC/Glu-EPSC比率較同期正常大鼠顯著降低。3.降解CSPG后,大鼠視皮層神經(jīng)元NMDA-EPSC幅值的增長(zhǎng)百分率明顯大于AMPA-EPSC

11、幅值的增長(zhǎng)百分率。這部分結(jié)果提示可塑性關(guān)鍵期后期到終止期CSPG對(duì)NMDA-EPSC具有選擇性抑制作用。
　　 第三部分研究:降解CSPG對(duì)大鼠視皮層NMDA/AMPA受體表達(dá)的影響。
　　 通過(guò)免疫熒光標(biāo)記技術(shù)和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)我們研究了可塑性關(guān)鍵期終止前后CSPG降解大鼠和正常大鼠視皮層NMDA受體和AMPA受體表達(dá)的變化。免疫熒光標(biāo)記結(jié)果顯示:1.P3W-P8W正常大鼠視皮層2-3層NR1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目無(wú)顯著性變化,4

12、層NR1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目在P5W以后顯著降低,P5W-P8W差異不顯著;P4W-P8WCSPG降解大鼠視皮層2-4層NR1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著高于同期正常大鼠。2.P3W-P8W正常大鼠視皮層2-3層GluR2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目隨發(fā)育增加,4層GluR2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目在P3W-P5W期間增加,P5W-P8W差異不顯著。P6W-P8WCSPG降解大鼠視皮層2-3層GluR2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著高于同期正常大鼠,P7W-P8WCSPG降解大鼠視皮層4層GluR

13、2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著高于同期正常大鼠。3.降解CSPG以后,大鼠視皮層2-4層NR1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的增長(zhǎng)百分率大于GluR2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的增長(zhǎng)百分率。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)的結(jié)果顯示:1.P3W-P4W正常大鼠視皮層NR1表達(dá)水平較高,然后逐漸降低,P3W-P4W與P7W-P8W之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,降解CSPG后,P4W-P8WCSPG降解大鼠視皮層NR1的表達(dá)水平顯著高于同期正常大鼠。2.正常大鼠GluR2表達(dá)水平在P3W-P6W隨發(fā)育逐漸升

14、高,P6W-P8W之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;降解CSPG后,P6W-P8WCSPG降解大鼠視皮層GluR2表達(dá)水平顯著高于同期正常大鼠。
　　 這些結(jié)果表明:從視覺(jué)可塑性關(guān)鍵期后期到終止期,視皮層神經(jīng)元NMDA受體是存在的,CSPG選擇性抑制NR1蛋白的表達(dá)水平而屏蔽了神經(jīng)元上NMDA受體與遞質(zhì)的結(jié)合;同時(shí),提示CSPG對(duì)視皮層神經(jīng)元AMPA受體的影響只表現(xiàn)在成年期。
　　 綜上所述,本研究可以得到以下結(jié)論:從視覺(jué)可塑性關(guān)鍵

15、期高峰到終止期,CSPG形成的PNNs選擇性地“屏蔽”了NMDA受體的表達(dá)和功能,導(dǎo)致AMPA受體的表達(dá)和功能相對(duì)增強(qiáng),AMPA受體在谷氨酸能興奮性突觸傳遞中發(fā)揮優(yōu)勢(shì)作用,興奮性突觸被增強(qiáng)和固化,突觸可塑性降低,可塑性關(guān)鍵期終止。因此CSPG形成的PNNs選擇性“屏蔽”谷氨酸能興奮性突觸中NMDA受體,導(dǎo)致了視皮層興奮性神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)NMDA受體和AMPA受體構(gòu)成比的變化。大鼠視皮層興奮性神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)NMDA受體和AMPA受體構(gòu)成比的變化是視