大豆異黃酮合成途徑基因的進(jìn)化分析及轉(zhuǎn)錄因子GmMYB184的功能鑒定.pdf

1、異黃酮是苯丙烷代謝途徑產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，主要存在于豆科植物中。異黃酮類次生代謝產(chǎn)物對(duì)于植物與微生物的互作非常重要，并且有著重要的醫(yī)療保健作用，因此提高異黃酮含量是大豆品質(zhì)育種的目標(biāo)之一。但是大豆異黃酮的合成代謝途徑非常復(fù)雜，對(duì)單個(gè)途徑酶進(jìn)行修飾的方法難以取得理想效果。蛋白互作的研究加深了我們對(duì)大豆異黃酮合成的分子機(jī)制的了解，對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子的研究能夠促進(jìn)大豆異黃酮或者其他農(nóng)藝性狀的改良，對(duì)大豆品質(zhì)的遺傳工程有所幫助。
　　異黃酮的合

2、成起始于苯丙烷代謝的公共途徑，從苯丙氨酸開(kāi)始，由一系列含有多個(gè)拷貝的酶催化，由分支節(jié)點(diǎn)酶導(dǎo)入異黃酮合成的分支途徑，最終形成異黃酮及異黃酮類衍生物。盡管苯丙烷代謝途徑包括其分支異黃酮代謝途徑是目前研究得比較透徹的次生代謝途徑，但是關(guān)于異黃酮代謝途徑基因的分子進(jìn)化仍然所知甚少，因此，研究關(guān)鍵基因的進(jìn)化模式，結(jié)合“metabolons”理論的途徑酶互作分析，有助于更透徹地了解異黃酮代謝途徑復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，鑒定一些調(diào)控途徑關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄因子

3、可以進(jìn)一步了解異黃酮合成調(diào)控的分子機(jī)制，為代謝工程和遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。
　　本研究通過(guò)對(duì)異黃酮代謝途徑基因進(jìn)行進(jìn)化模式的分析，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因經(jīng)歷了相似的選擇模式，并表現(xiàn)出趨同進(jìn)化，推測(cè)這些酶可能形成大分子蛋白復(fù)合物。用酵母雙雜的方法對(duì)途徑一部分酶的拷貝組合進(jìn)行了互作分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IFS能夠與分支節(jié)點(diǎn)酶CHS、CHR互作，CHI能夠與CHS、CHR互作，PAL能夠與C4H互作。這些結(jié)果一定程度證明了這樣的大分子蛋白復(fù)合物存在的

4、可能性。
　　此外，本研究克隆了一個(gè)大豆非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GmMYB184并進(jìn)行了初步的功能驗(yàn)證。亞細(xì)胞定位研究證實(shí)了GmMYB184轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞核定位。組織表達(dá)分析表明了該轉(zhuǎn)錄因子基因與IFS2的表達(dá)模式相同，在根和成熟種子中大量表達(dá)，并且隨著種子發(fā)育，表達(dá)量上升。同時(shí)，GmMYB184和IFS2的表達(dá)模式與異黃酮的積累模式相似。谷胱甘肽誘導(dǎo)表達(dá)分析表明該轉(zhuǎn)錄因子基因與IFS2共誘導(dǎo)，可能參與相似的生物過(guò)程。采用雙熒光

5、素酶報(bào)告系統(tǒng)分析其對(duì)異黃酮合成途徑關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄激活活性影響，發(fā)現(xiàn)GmMYB184能夠分別促進(jìn)CHS8和IFS2啟動(dòng)子表達(dá)活性提高5倍和7倍。最后通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，找到該轉(zhuǎn)錄因子在異黃酮合成調(diào)控中的直接作用證據(jù)。沉默GmMYB184導(dǎo)致異黃酮含量的顯著下降，表明GmMYB184轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于異黃酮的合成過(guò)程是必須的。但是，過(guò)表達(dá)GmMYB184不足以顯著提高毛狀根中異黃酮的含量。
　　總之，本研究從進(jìn)化選擇、蛋白互作和轉(zhuǎn)