護(hù)骨素對(duì)高糖環(huán)境人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、[背景]
　　 糖尿病血管病變是糖尿病患者致殘致死的主要原因，目前對(duì)高血糖引起糖尿病血管病變的機(jī)制還不十分清楚。血管內(nèi)皮細(xì)胞襯覆于血管內(nèi)壁，直接影響血管壁的穩(wěn)定及功能健全。有研究顯示，體外高糖環(huán)境可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)多凋亡破壞內(nèi)皮完整性及功能，是糖尿病血管病變發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，表明血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與糖尿病血管并發(fā)癥密切相關(guān)。結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(TSC-mTORC1)信號(hào)通路調(diào)

2、節(jié)細(xì)胞凋亡，亦可能在糖尿病血管并發(fā)癥中起重要作用。
　　 護(hù)骨素是腫瘤壞死因子受體超家族的成員，因可抑制破骨細(xì)胞分化和功能上調(diào)骨密度而得名。國(guó)內(nèi)外臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者體內(nèi)護(hù)骨素水平顯著增高，與糖尿病血管并發(fā)癥及血管內(nèi)皮功能異常密切相關(guān)。一種觀點(diǎn)認(rèn)為，臨床研究得出的結(jié)果“病變?cè)街兀o(hù)骨素水平越高”比較直觀地反映護(hù)骨素可能是血管病變的危險(xiǎn)因素;另一種更為普遍接受的觀點(diǎn)是，血管病變護(hù)骨素水平的升高是機(jī)體一種代償性的防御機(jī)制，可避免

3、血管進(jìn)一步受損，因此也有學(xué)者將護(hù)骨素稱為“血管保護(hù)素”。然而，護(hù)骨素對(duì)高糖環(huán)境人血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用及機(jī)制仍不清楚。
　　 [目的]
　　 本研究通過(guò)體外高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的高糖損傷模型，探討護(hù)骨素對(duì)高糖環(huán)境人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制，旨在為護(hù)骨素在未來(lái)防治糖尿病血管病變等方面的應(yīng)用研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 [方法]
　　 1、體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞高糖損傷模型的建立<

4、br>　　 體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，隨機(jī)分為2組:①正糖對(duì)照組(葡萄糖終濃度為5.5mmol/L);②高糖組(葡萄糖終濃度分別為11mmol/L、22mmol/L、33mmol/L、44mmol/L)。用相應(yīng)的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)不同時(shí)間(24h、48h、72h、96h)后收集細(xì)胞，MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖率;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布。
　　 2、護(hù)骨素對(duì)高糖環(huán)境人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制
　　 實(shí)驗(yàn)

5、1分為4組:①正糖對(duì)照組（葡萄糖終濃度為5.5mmol/L）;②高糖組（葡萄糖終濃度為33mmol/L）;③高糖+護(hù)骨素組（0.5、1、2μg/mL護(hù)骨素分別預(yù)培養(yǎng)24h，加33mmol/L葡萄糖）;④高滲對(duì)照組（5.5mmol/L葡萄糖+27.5mmol/L甘露醇）。加入相應(yīng)的培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;Hoechst33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化;并用倒置相差顯微鏡觀察24h劃痕實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞的遷移力。

6、r>　　 實(shí)驗(yàn)2分為4組:①正糖對(duì)照組(葡萄糖終濃度為5.5mmol/L);②高糖組（葡萄糖終濃度為33mmol/L）;③高糖+護(hù)骨素組（2μg/mL護(hù)骨素預(yù)培養(yǎng)24h，加33mmol/L葡萄糖）;④高糖+雷帕霉素組（10ng/mL雷帕霉素預(yù)培養(yǎng)24h，加33mmol/L葡萄糖）。加入相應(yīng)的培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，Westernblot檢測(cè)Tuberin、P-Tuberin、S6K、P-S6K、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平。

7、r>　　 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((-x)±s)表示。組間均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 1、體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞高糖損傷模型的建立
　　 1)倒置相差顯微鏡下觀察體外正糖培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
　　 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在4h時(shí)可見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁，

8、伸出偽足;24h時(shí)，細(xì)胞完全貼壁，并呈單層排列，邊界清楚，為圓形、短梭形或扁平多角形;3～4d融合成單層，如鋪路石鑲嵌排列，有些細(xì)胞則呈魚貫狀相連，間有旋渦狀排列;5～6d細(xì)胞生長(zhǎng)融合成致密單層，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。
　　 2)臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)每次實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞活力
　　 正常的活細(xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)，使之不能夠進(jìn)入胞內(nèi);而喪失活性或細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率＞

9、95％。
　　 3)MTT比色法繪制體外正糖培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
　　 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種后第1d，細(xì)胞較接種時(shí)無(wú)明顯變化，此時(shí)細(xì)胞仍處于滯留期，第2d則明顯增加，第3～5d增長(zhǎng)迅速，達(dá)到其生長(zhǎng)高峰，此時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第6d細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，處于生長(zhǎng)平臺(tái)期。
　　 4)MTT比色法檢測(cè)高糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響
　　 正糖對(duì)照組（5.5mmol/L葡萄糖）細(xì)胞從24h～72h持續(xù)增殖，培

10、養(yǎng)至96h細(xì)胞光密度值（OD值）降低。11mmol/L、22mmol/L高糖組細(xì)胞OD值在24h～96h內(nèi)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增高，但24h～72h兩組細(xì)胞OD值的增長(zhǎng)均低于同時(shí)間點(diǎn)正糖對(duì)照組，細(xì)胞增殖速度慢，融合延遲。33mmol/L、44mmol/L高糖組細(xì)胞OD值在24h～96h內(nèi)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，兩組細(xì)胞OD值均顯著低于同時(shí)間點(diǎn)正糖對(duì)照組(P＜0.05)，呈時(shí)間-濃度依賴趨勢(shì)。
　　 5)流式細(xì)胞術(shù)(Annexi

11、nV-FITC/PI雙染法)檢測(cè)高糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響
　　 正糖對(duì)照組（5.5mmol/L葡萄糖）和高糖組細(xì)胞凋亡率均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而遞增。與同時(shí)間點(diǎn)正糖對(duì)照組比較，不同濃度高糖組細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯增高(P＜0.05)，并呈時(shí)間-濃度依賴趨勢(shì)。
　　 6)流式細(xì)胞術(shù)（碘化丙啶染色法）檢測(cè)高糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞周期分布的影響
　　 正糖對(duì)照組（5.5mmol/L葡萄糖）和高糖組細(xì)胞培養(yǎng)2

12、4h細(xì)胞周期未見(jiàn)明顯改變;培養(yǎng)48h～96h，與同時(shí)間點(diǎn)正糖對(duì)照組比較，高糖組G0/G1期細(xì)胞比例增加，S和G2/M期細(xì)胞比例下降，且具有濃度依賴趨勢(shì)。
　　 2、護(hù)骨素對(duì)高糖環(huán)境人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制
　　 1)流式細(xì)胞術(shù)(AnnexinV-FITC/PI雙染法)檢測(cè)護(hù)骨素對(duì)高糖環(huán)境人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響
　　 正糖對(duì)照組、高糖組、高糖+護(hù)骨素組、高滲對(duì)照組各組細(xì)胞培養(yǎng)48h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人臍

13、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，與正糖對(duì)照組相比，高糖組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P＜0.05);高糖+護(hù)骨素組細(xì)胞凋亡率明顯低于高糖組(P＜0.05)，而又高于正糖對(duì)照組(P＜0.05)，并呈濃度依賴趨勢(shì);高滲對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率與正糖對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 2)Hoechst33258染色觀察護(hù)骨素對(duì)高糖環(huán)境人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響
　　 各組細(xì)胞經(jīng)DNA熒光染料Hoechst33258染色后，在熒

14、光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化。結(jié)果顯示，正常細(xì)胞核內(nèi)DNA分布相對(duì)均勻，核無(wú)固縮，在視野中呈現(xiàn)體積較大的淺染核形態(tài)，而凋亡細(xì)胞核內(nèi)DNA濃聚，核出現(xiàn)不同程度的固縮，在視野中呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染的深染核形態(tài)，有細(xì)胞凋亡的典型特征。正糖對(duì)照組細(xì)胞偶有凋亡;高糖組細(xì)胞凋亡明顯增多;高糖+護(hù)骨素組細(xì)胞凋亡較高糖組有所減輕，但凋亡細(xì)胞仍多于正糖對(duì)照組;高滲對(duì)照組與正糖對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。
　　 3)劃痕實(shí)驗(yàn)觀察護(hù)骨素對(duì)高糖環(huán)

15、境人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移力的影響
　　 正糖對(duì)照組、高糖組、高糖+護(hù)骨素組各組細(xì)胞培養(yǎng)24h，倒置相差顯微鏡下觀察劃痕處的細(xì)胞生長(zhǎng)情況并拍照，通過(guò)對(duì)比同一空間位置不同時(shí)間點(diǎn)拍下的照片得到細(xì)胞遷移的數(shù)據(jù)，以劃痕寬度變化表示細(xì)胞遷移力的大小，劃痕寬度變化愈大，則表示細(xì)胞遷移力愈強(qiáng)。結(jié)果顯示，與正糖對(duì)照組相比，高糖組內(nèi)皮細(xì)胞遷移力減弱;高糖+護(hù)骨素組細(xì)胞遷移力低于正糖對(duì)照組，而又高于高糖組。
　　 4)Westernblot檢測(cè)

16、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞馬鈴薯球蛋白(Tuberin)、磷酸化馬鈴薯球蛋白(P-Tuberin)、核糖體蛋白S6激酶(S6K)、磷酸化核糖體蛋白S6激酶(P-S6K)、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)
　　 為探討護(hù)骨素對(duì)高糖環(huán)境人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制，Westernblot檢測(cè)mTORC1上游Tuberin、P-Tuberin和mTORC1下游S6K、P-S6K蛋白表達(dá)水平;為闡明Tuberin/S6K是否激活凋亡相關(guān)通路，West

17、ernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)水平;為進(jìn)一步研究抑制mTORC1途徑是否能阻滯凋亡相關(guān)通路的激活，10ng/mL雷帕霉素預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞24h，再給予33mmol/L葡萄糖培養(yǎng)48h，Westernblot檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Tuberin、P-Tuberin、S6K、P-S6K、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與正糖對(duì)照組比較，高糖組P-Tuberin、P-Tuberin/Tuberin、S6K、P-S6K/

18、S6K、Bax表達(dá)水平顯著增高(P＜0.05)，Bcl-2表達(dá)顯著降低(P＜0.05);高糖+護(hù)骨素組P-Tuberin、P-Tuberin/Tuberin、S6K、P-S6K/S6K、Bax表達(dá)水平明顯低于高糖組，而又高于正糖對(duì)照組(P＜0.05)，Bcl-2表達(dá)明顯高于高糖組，而又低于正糖對(duì)照組(P＜0.05);高糖+雷帕霉素組與高糖+護(hù)骨素組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 [結(jié)論]
　　 1、高糖作用下，

19、體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖降低、凋亡增加、細(xì)胞周期阻滯在G1/S期，并呈時(shí)間-濃度依賴趨勢(shì);33mmol/L葡萄糖濃度、48h作用時(shí)間點(diǎn)可能是體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞高糖損傷模型的合適實(shí)驗(yàn)條件。
　　 2、高糖環(huán)境人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加，其機(jī)制可能與高糖激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞TSC-mTORC1活性，進(jìn)而上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2表達(dá)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　 3、護(hù)骨素對(duì)體外高糖誘導(dǎo)損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用