RAS--線粒體依賴的自噬對(duì)高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:高糖誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的功能研究
　　目的:
　　本研究主要探討不同葡萄糖濃度或者高葡萄糖濃度下不同作用時(shí)間對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老、自噬及凋亡的影響。
　　方法:
　　1.HUVEC在無血清ECM培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)后，加入不同濃度葡萄糖(11，16.5，22，27.5，33mM)共同作用72h，或者33mM葡萄糖分別作用72，48，24，6h。ECM培養(yǎng)基基礎(chǔ)葡萄糖濃度5.5mM。同時(shí)給予33mM

2、甘露醇作為對(duì)照排除滲透壓升高的影響。
　　2.葡萄糖處理后，分別行細(xì)胞周期、β-半乳糖苷酶染色、細(xì)胞衰老相關(guān)異染色質(zhì)聚集(SAHF)和衰老相關(guān)蛋白檢測(cè)評(píng)估細(xì)胞衰老。
　　3.葡萄糖處理后，檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白及自噬啟動(dòng)蛋白的表達(dá)，并分別給予AICAR、CC調(diào)控自噬啟動(dòng)蛋白AMPK，評(píng)估葡萄糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞自噬的影響。
　　4.葡萄糖處理后，流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估葡萄糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1.葡萄糖呈現(xiàn)濃

3、度及劑量依賴性地促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老，且這種促進(jìn)與滲透壓改變無關(guān)。
　　2.葡萄糖誘導(dǎo)自噬標(biāo)志蛋白及自噬啟動(dòng)蛋白的高表達(dá)，且獨(dú)立于滲透壓改變。抑制AMPK磷酸化反應(yīng)可以廢除高糖誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)。
　　3.培養(yǎng)條件下，高糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡無明顯影響。
　　結(jié)論:
　　本研究表明，高糖可以明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞衰老、自噬，但對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡無明顯影響。且內(nèi)皮細(xì)胞損傷為滲透壓非依賴性。
　　第二部分:RAS-線粒

4、體損傷在高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮損傷中的作用研究
　　目的:
　　本研究探討RAS-線粒體損傷在高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮損傷中發(fā)揮的作用。
　　方法:
　　1.葡萄糖處理后，檢測(cè)ACE1、AGTR1、AGTR2 mRNA和蛋白水平變化。
　　2.葡萄糖處理后，分別行線粒體膜電位、活性氧、NADPH、胞漿Ca2+、細(xì)胞色素C定位檢測(cè)評(píng)估線粒體功能。
　　3.在HUVEC中加入AngⅡ(1uM)作用72h，模擬

5、33mM葡萄糖作用72h對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體損傷、細(xì)胞衰老、細(xì)胞自噬的影響。
　　4.在HUVEC中分別加入Benazepril(1uM)、Losartan(10uM)作用6h后，與33mM葡萄糖共同孵育72h，檢測(cè)線粒體損傷、細(xì)胞衰老、細(xì)胞自噬。
　　5.應(yīng)用CCCP直接誘導(dǎo)線粒體通透孔開放，觀察人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老、自噬及凋亡反應(yīng)。CCCP與Benazepril及Losartan共同孵育，觀察線粒體損傷、細(xì)胞凋亡、自噬及衰老

6、反應(yīng)。
　　結(jié)果:
　　1.葡萄糖誘導(dǎo)ACE1、AGTR1 mRNA和蛋白的高表達(dá)，但對(duì)AGTR2的表達(dá)無明顯改變。
　　2.葡萄糖誘導(dǎo)線粒體膜電位降低、NADPH表達(dá)下降、活性氧表達(dá)增高、胞漿Ca2+超載、細(xì)胞色素C與線粒體解耦連。
　　3.AngⅡ作用72h模擬高糖誘導(dǎo)的線粒體損傷，內(nèi)皮細(xì)胞衰老及自噬反應(yīng)增加。
　　4.Benazepril或Losartan可以改善高糖誘導(dǎo)的線粒體損傷及內(nèi)皮細(xì)胞損傷反應(yīng)

7、。
　　5.線粒體通透孔完全開放可以誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、自噬反應(yīng)高表達(dá)。低劑量CCCP對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡無影響。
　　6.線粒體通透孔開放完全逆轉(zhuǎn)Benazepril及Losartan對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　結(jié)論:
　　本研究結(jié)果表明，葡萄糖通過ACE1、AGTR1的激活誘導(dǎo)線粒體損傷，而線粒體損傷誘發(fā)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老、自噬及凋亡反應(yīng)增強(qiáng)。
　　第三部分:自噬限制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老及凋亡

8、>　　目的:
　　本研究探討細(xì)胞自噬對(duì)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老和凋亡的影響，同時(shí)進(jìn)一步研究其可能的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.在HUVEC中加入不同的自噬抑制劑（3-MA、CC）及自噬激動(dòng)劑(AICAR、CCCP)后，觀察內(nèi)皮細(xì)胞衰老、凋亡變化情況。
　　2.對(duì)自噬小體骨架分子LC3、beclin1分別行siRNA干擾，觀察內(nèi)皮細(xì)胞衰老、凋亡。
　　3.3-MA分別與Benazepril及Losa

9、rtan共同孵育，觀察內(nèi)皮細(xì)胞衰老、凋亡。
　　結(jié)果:
　　1.3-MA、CC加速高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老、凋亡，AICAR、CCCP部分逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老、凋亡。
　　2.LC3、beclin1 siRNA干擾促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
　　3.3-MA廢除Benazepril及Losartan誘導(dǎo)的衰老延遲，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論:
　　本研究表明，自噬限制高糖

10、誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老及凋亡。
　　第四部分:糖尿病患者及糖尿病大鼠血管內(nèi)皮中存在自噬標(biāo)志物、衰老標(biāo)志分子聚集和衰老細(xì)胞表達(dá)增加
　　目的:
　　本研究驗(yàn)證自噬、衰老、凋亡在糖尿病患者及糖尿病大鼠動(dòng)脈血管內(nèi)皮中的表達(dá)情況，并觀察Benazepril及Losartan對(duì)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能的保護(hù)作用。
　　方法:
　　1.腹腔注射STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，分別給予benazepril、 losartan

11、、生理鹽水每日灌胃，持續(xù)灌胃8周。
　　2.大鼠麻醉后，檢測(cè)內(nèi)皮依賴性血管舒張功能及內(nèi)皮非依賴性血管舒張功能。
　　3.免疫組化檢測(cè)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮中自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá)。
　　4.ELISA檢測(cè)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮SA-β-gal表達(dá)。
　　5.TUNEL檢測(cè)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
　　6.Weastern blot檢測(cè)糖尿病患者動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬、凋亡及衰老標(biāo)志蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　

12、　1.糖尿病大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性血管舒張功能受損，內(nèi)皮非依賴性血管舒張功能無明顯改變;血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白、SA-β-gal表達(dá)，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率上升。
　　2.benazepril、losartan可以改善糖尿病大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性血管舒張功能受損，降低血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白、SA-β-gal表達(dá)，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率。
　　3.糖尿病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬、凋亡及衰老標(biāo)志蛋白的表達(dá)量增高。
　　結(jié)論: