絞股藍(lán)提取物對(duì)衰老機(jī)體抗氧化功能及DNA損傷影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：絞股藍(lán)(GynostemmapentaphyllumMakino)植物在我國(guó)約有¨種，其中所含的化學(xué)成分豐富。近年來(lái)經(jīng)國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究證明，絞股藍(lán)含有豐富的人參皂甙，如人參皂甙Rb1、Rb3、Rd、F2、K和Rg3；多種人體必需的氨基酸和微量元素，如鍺、硒、鋅。絞股藍(lán)具有抗衰老、抗?jié)?、抑制癌?xì)胞增殖、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種生物功能，特別是其抗衰老作用日益引起關(guān)注。但是，絞股藍(lán)在DNA分子水平的抗衰老作用及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響的研究卻少

2、有報(bào)道。 目的：觀察不同劑量絞股藍(lán)提取物抗氧化、延緩機(jī)體衰老的效果，檢測(cè)其對(duì)DNA損傷和細(xì)胞凋亡的影響。以便從分子生物學(xué)水平探討絞股藍(lán)提取物延緩衰老的機(jī)理，研究劑量-反應(yīng)關(guān)系，為絞股藍(lán)保健功能的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)擬對(duì)本論文所采用的DNA損傷檢測(cè)方法進(jìn)行初步分析，為今后開(kāi)展DNA損傷的分子流行病學(xué)研究提供方法學(xué)參考。 方法：采用成年Wistar大鼠(3～4月齡)94只，雌雄各半，體重190～245克?；A(chǔ)飼料適應(yīng)性

3、喂養(yǎng)1w后，隨機(jī)分為6組，每組14～16只，分別為正常對(duì)照組、衰老對(duì)照組、維生素E+維生素C組(以下簡(jiǎn)稱維生素EC組)、絞股藍(lán)1組、絞股藍(lán)2組和絞股藍(lán)3組。除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠每日頸背部皮下注射D-半乳糖100mg/kgBW以建立衰老動(dòng)物模型，正常對(duì)照組皮下注射等量的生理鹽水。正常對(duì)照組和衰老對(duì)照組大鼠喂飼基礎(chǔ)飼料，維生素EC組在基礎(chǔ)飼料中添加維生素E200mg/kg飼料和維生素C1000mg/kg飼料；絞股藍(lán)1、2、3組分別添

4、加絞股藍(lán)提取物200mg/kg飼料、800mg/kg飼料和4000mg/kg飼料。實(shí)驗(yàn)期為8周，大鼠自由進(jìn)食及飲水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，定期稱大鼠體重，第7周留取尿液。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后腹主動(dòng)脈取血進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)分析。 1.大鼠抗氧化能力測(cè)定：采用試劑盒測(cè)定血漿中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)以及丙二醛(MDA)含量；采用熒光偏振法測(cè)定紅細(xì)胞膜流動(dòng)性。 2.大鼠DNA損傷和細(xì)胞凋亡測(cè)定：分離血樣，收集淋

5、巴細(xì)胞；取腦、肝臟，制作石蠟切片。采用單細(xì)胞凝膠電泳法(SCGE)檢測(cè)淋巴細(xì)胞DNA自發(fā)及H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷；用毛細(xì)管電泳法測(cè)定尿中O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤(O6-MeG)的含量；采用免疫組織化學(xué)法顯示Bcl-2蛋白、P53蛋白的表達(dá)情況，并利用圖像分析技術(shù)進(jìn)行定量分析。 結(jié)果： 1.大鼠抗氧化能力分析結(jié)果顯示： ①與正常對(duì)照組相比，衰老對(duì)照組大鼠血漿SOD、GSH-Px活性和MDA含量分別為128.70NU/ml、

6、338.42酶活力單位和6.55nmol/ml，SOD和GSH-Px活性分別下降20.3％和19.9％(P＜0.01)，MDA含量升高16.1％；絞股藍(lán)1組GSH-Px活性下降14.5％，絞股藍(lán)1和2組MDA含量分別升高12.4％和10.3％(P＜0.05)。與衰老對(duì)照組相比，維生素EC組血漿SOD及GSH-Px活性分別升高至150.48NU/ml和397.27酶活力單位，MDA含量下降至5.82nmol/ml(P＜0.05)；而絞股藍(lán)

7、3組SOD和GSH-Px活性顯著升高，分別達(dá)到152.43NU/ml(P＜0.05)和412.00酶活力單位(P＜0.01)，MDA含量下降至5.91nmol/ml(P＜0.05)。說(shuō)明絞股藍(lán)提取物可提高D-半乳糖致衰老大鼠血漿SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量。但只有高劑量絞股藍(lán)提取物作用明顯，能使血漿SOD、GSH-Px活性及MDA含量恢復(fù)至接近正常水平，與聯(lián)合補(bǔ)充維生素E、C作用相近。 ②紅細(xì)胞膜流動(dòng)性分析結(jié)果顯示：

8、與正常對(duì)照組比較，衰老對(duì)照組、絞股藍(lán)1組、絞股藍(lán)2組P值分別為0.323、0.319、0.317，η值分別為4.813和4.616、4.512，均顯著升高(P＜0.05)。與衰老對(duì)照組相比，維生素EC組的P值和η值分別為0.307和4.173，絞股藍(lán)3組P值和η值為0.303和4.016，均顯著降低(P＜0.05)；而絞股藍(lán)3組與絞股藍(lán)1組相比，P值、η值也出現(xiàn)降低(P＜0.05)。說(shuō)明D-半乳糖致衰老各組P值、η值有隨絞股藍(lán)提取物劑量

9、的增加而降低的趨勢(shì)，顯示膜流動(dòng)性隨之增強(qiáng)。高劑量絞股藍(lán)提取物作用明顯，能使膜流動(dòng)性恢復(fù)至接近正常水平，與聯(lián)合補(bǔ)充維生素E、C作用相近。 2.大鼠DNA損傷和細(xì)胞凋亡測(cè)定顯示： ①SCGE檢測(cè)H2O2誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞DNA損傷結(jié)果顯示：各組淋巴細(xì)胞DNA自發(fā)損傷差異無(wú)顯著性(P＞0.05)；采用5、10和25μmol/LH2O2氧化時(shí)，衰老對(duì)照組DNA氧化損傷分別達(dá)到179.38、219.88和262.43AU(P＜0.05

10、)，與其相比，絞股藍(lán)1組、2組和3組以及維生素EC組DNA氧化損傷均明顯降低(P＜0.05)，但是絞股藍(lán)2、3組DNA氧化損傷與正常對(duì)照組及維生素EC組差別無(wú)顯著性。 ②尿中O6-MeG含量檢測(cè)結(jié)果顯示：衰老對(duì)照組大鼠尿中O6-MeG含量較其他各組偏高，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 ③P53蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，衰老對(duì)照組肝和腦P53蛋白表達(dá)平均光密度值分別升至0.207740和0.184997

11、、絞股藍(lán)1組分別升至0.175305和0.156304，維生素EC組腦平均光密度值也明顯升高(P＜0.05)；而衰老對(duì)照組肝和腦平均光密度值較其他各組也顯著升高(P＜0.01)，說(shuō)明P53蛋白表達(dá)強(qiáng)于其它各組。絞股藍(lán)1組較正常對(duì)照組和維生素EC組肝、腦平均光密度值及絞股藍(lán)3組肝平均光密度值均升高(P＜0.05)，但較衰老對(duì)照組降低，說(shuō)明該組P53蛋白表達(dá)處于中等強(qiáng)度。 ④Bcl-2蛋白表達(dá)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，

12、衰老對(duì)照組大鼠肝和腦Bcl-2蛋白表達(dá)平均光密度值分別為0.357382和0.332599、維生素EC組分別為0.412761和0.357589、絞股藍(lán)1組分別為0.385556和0.344915，絞股藍(lán)2組肝平均光密度值為0.416365，均顯著降低(P＜0.05)，說(shuō)明正常對(duì)照組Bcl-2蛋白表達(dá)強(qiáng)于以上各組。除絞股藍(lán)1組外，其它各組較衰老對(duì)照組平均光密度值顯著升高(P＜0.01)，且絞股藍(lán)1組平均光密度值低于正常對(duì)照組、維生素EC

13、組、絞股藍(lán)2、3組(P＜0.05)，說(shuō)明該組Bcl-2蛋白表達(dá)處于中等強(qiáng)度水平。 小結(jié)： 1.絞股藍(lán)提取物具有抗氧化作用，能增強(qiáng)衰老大鼠血漿抗氧化酶SOD、GSH-Px活性，降低脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量，維持紅細(xì)胞膜流動(dòng)性；同時(shí)具有提高衰老大鼠DNA抗氧化損傷能力、減少細(xì)胞凋亡的作用。且隨劑量的增加，作用效果逐步增強(qiáng)，補(bǔ)充大劑量絞股藍(lán)提取物(4000mg/kg)作用最強(qiáng)，與聯(lián)合補(bǔ)充維生素EC作用相近。 2.SCG