機械離心力對成骨細胞分化機制及骨改建的研究.pdf

1、[目的]
　　通過研究機械離心力(mechanical centrifugal force)對大鼠成骨細胞(osteoblast，OB)細胞骨架、細胞增殖（CCK-8）和分化標志物堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性的影響;闡明機械離心力對大鼠OB生物學功能的影響;通過研究機械離心力對大鼠OB分化密切相關的基因(Runx2，OPN、CollagenⅠ)表達變化的影響，闡明大鼠OB分化成骨可能的機制與骨形

2、態(tài)發(fā)生蛋白信號通路的關系。
　　[方法]
　　1.使用膠原酶消化法[1]分離大鼠OB，使用MGG、茜素紅、ALP三種化學染色方法來鑒定分離的大鼠OB。
　　2.觀察機械力加載下大鼠OB增殖、分化及細胞骨架的變化。
　　本實驗將生長良好的大鼠OB隨機分為A、B、C、D四個組，使用細胞機械離心力加載系統(tǒng)使用A=0×g、B=110×g、C=210×g、D=310×g[2，3]不同程度的機械離心力刺激大鼠OB5min，加

3、力結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)1h、6h、18h、24h四個時間點。初步分析大鼠OB生物學功能變化。
　　3.檢測大鼠OB在機械離心力作用下其分化相關基因表達情況，分析機械離心力促進大鼠OB分化成骨的可能機制。
　　根據(jù)上述實驗結(jié)果選擇合適加力力值，刺激大鼠OB5min，加力結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)1h、6h、18h、24h四個時間點。利用實時熒光定量PCR對成骨細胞分化的相關基因OPN、ColⅠ、Runx2 mRNA表達的水平進行測定。
　

4、　利用Noggin能與BMPs緊密結(jié)合，阻止BMPs與其他受體結(jié)合從而阻斷BMP信號通路的傳導[4]。細胞加力前使細胞同步化并分組，實驗分組:A組:0×g+Noggin;B組:0×g-Noggin;C組:合適力值×g+Noggin;D組:合適力值×g-Noggin，上述四組細胞加力完成后培養(yǎng)1h提取RNA，觀察四組細胞Runx2mRNA的表達變化。
　　[結(jié)果]
　　1.大鼠成骨細胞的分離及鑒定[1]
　　膠原酶消化法

5、分離大鼠OB， MGG染色觀察細胞充分伸展，呈梭形、不規(guī)則多邊形;ALP染色觀察胞膜及胞漿內(nèi)顆粒染色呈棕色或咖啡色;茜素紅染色觀察到在細胞團處有橘紅色鈣化結(jié)節(jié);鑒定分離細胞具備大鼠OB典型形態(tài)及標志性特征。
　　2.機械離心力對成骨細胞增殖、分化功能及細胞骨架狀態(tài)的影響
　　行預實驗，觀察其細胞增殖功能狀態(tài)情況，連續(xù)加載5天發(fā)現(xiàn)連續(xù)的離心力加載細胞增殖數(shù)據(jù)無顯著性差異，機械離心力刺激大鼠OB細胞活性無明顯異常。查閱相關文獻[

6、3，5，6]，選擇210×g的離心力加載細胞5min，加力后培養(yǎng)1h、6h、18h、24h后與對照組相比，結(jié)果提示1h、6h細胞增殖活性未見明顯變化，6h后細胞增殖活性開始下降，18h的細胞增殖活性明顯降低，24h后細胞增殖活性逐步恢復正常并略升高。
　　ALP活性在機械離心力作用下升高顯著:先給大鼠OB行離心力0×g、110×g、210×g、310×g加載5min，培養(yǎng)6h后與對照組相比，離心力可以顯著增強細胞ALP活性，其中2

7、10×g機械刺激加載的細胞ALP活性增加最明顯;選擇210×g的離心力刺激細胞后培養(yǎng)1h、6h、18h、24h，觀察了不同時間點細胞ALP活性的變化。發(fā)現(xiàn)與對照組相比1h，6h的ALP活性增高，18h，24h的ALP活性逐步恢復正常。
　　考馬斯亮藍R250染色細胞骨架:形態(tài)學觀察表明，1h實驗組的成骨細胞細胞骨架表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)收縮、染色變淡、稀疏、變細。去除此刺激后，隨時間延長，12h實驗組細胞骨架逐漸恢復，表現(xiàn)為細胞骨架染色顏色加

8、深，放射狀應力纖維增多、增粗，兩組間差異隨時間延長逐漸減小，24h的實驗組與對照組間未見明顯差異。
　　3.機械離心力作用下大鼠OB的Runx2、OPN及ColⅠ mRNA的表達變化
　　利用熒光定量PCR對Runx2 mRNA表達的水平進行了測定，細胞加力后發(fā)現(xiàn)1h的Runx2 mRNA的表達水平與對照比較顯著增加(P＜0.05)，6h后其表達水平逐漸穩(wěn)定，恢復到未加力水平，18h、24h無明顯差異。阻斷BMP信號通路結(jié)果

9、顯示，Runx2 mRNA表達在D組較B組明顯增高(P＜0.05)，C組比D組明顯降低(P＜0.05）;A、C組與B組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　OPN mRNA及ColⅠ mRNA的表達變化:與空白對照組相比1h、6h時間點OPN mRNA及ColⅠ mRNA表達水平與對照組相比均升高，但6h后其水平逐漸回落至未加力水平，18h、24h的時間點與對照組相比未檢測到顯著的變化點。
　　[結(jié)論]
　　1.機械離