機(jī)械離心力對(duì)成骨細(xì)胞分化機(jī)制及骨改建的研究.pdf

1、[目的]
　　通過(guò)研究機(jī)械離心力(mechanical centrifugal force)對(duì)大鼠成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)細(xì)胞骨架、細(xì)胞增殖（CCK-8）和分化標(biāo)志物堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性的影響;闡明機(jī)械離心力對(duì)大鼠OB生物學(xué)功能的影響;通過(guò)研究機(jī)械離心力對(duì)大鼠OB分化密切相關(guān)的基因(Runx2，OPN、CollagenⅠ)表達(dá)變化的影響，闡明大鼠OB分化成骨可能的機(jī)制與骨形

2、態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)通路的關(guān)系。
　　[方法]
　　1.使用膠原酶消化法[1]分離大鼠OB，使用MGG、茜素紅、ALP三種化學(xué)染色方法來(lái)鑒定分離的大鼠OB。
　　2.觀察機(jī)械力加載下大鼠OB增殖、分化及細(xì)胞骨架的變化。
　　本實(shí)驗(yàn)將生長(zhǎng)良好的大鼠OB隨機(jī)分為A、B、C、D四個(gè)組，使用細(xì)胞機(jī)械離心力加載系統(tǒng)使用A=0×g、B=110×g、C=210×g、D=310×g[2，3]不同程度的機(jī)械離心力刺激大鼠OB5min，加

3、力結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)1h、6h、18h、24h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)。初步分析大鼠OB生物學(xué)功能變化。
　　3.檢測(cè)大鼠OB在機(jī)械離心力作用下其分化相關(guān)基因表達(dá)情況，分析機(jī)械離心力促進(jìn)大鼠OB分化成骨的可能機(jī)制。
　　根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇合適加力力值，刺激大鼠OB5min，加力結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)1h、6h、18h、24h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)成骨細(xì)胞分化的相關(guān)基因OPN、ColⅠ、Runx2 mRNA表達(dá)的水平進(jìn)行測(cè)定。
　

4、　利用Noggin能與BMPs緊密結(jié)合，阻止BMPs與其他受體結(jié)合從而阻斷BMP信號(hào)通路的傳導(dǎo)[4]。細(xì)胞加力前使細(xì)胞同步化并分組，實(shí)驗(yàn)分組:A組:0×g+Noggin;B組:0×g-Noggin;C組:合適力值×g+Noggin;D組:合適力值×g-Noggin，上述四組細(xì)胞加力完成后培養(yǎng)1h提取RNA，觀察四組細(xì)胞Runx2mRNA的表達(dá)變化。
　　[結(jié)果]
　　1.大鼠成骨細(xì)胞的分離及鑒定[1]
　　膠原酶消化法

5、分離大鼠OB， MGG染色觀察細(xì)胞充分伸展，呈梭形、不規(guī)則多邊形;ALP染色觀察胞膜及胞漿內(nèi)顆粒染色呈棕色或咖啡色;茜素紅染色觀察到在細(xì)胞團(tuán)處有橘紅色鈣化結(jié)節(jié);鑒定分離細(xì)胞具備大鼠OB典型形態(tài)及標(biāo)志性特征。
　　2.機(jī)械離心力對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化功能及細(xì)胞骨架狀態(tài)的影響
　　行預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察其細(xì)胞增殖功能狀態(tài)情況，連續(xù)加載5天發(fā)現(xiàn)連續(xù)的離心力加載細(xì)胞增殖數(shù)據(jù)無(wú)顯著性差異，機(jī)械離心力刺激大鼠OB細(xì)胞活性無(wú)明顯異常。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[

6、3，5，6]，選擇210×g的離心力加載細(xì)胞5min，加力后培養(yǎng)1h、6h、18h、24h后與對(duì)照組相比，結(jié)果提示1h、6h細(xì)胞增殖活性未見(jiàn)明顯變化，6h后細(xì)胞增殖活性開(kāi)始下降，18h的細(xì)胞增殖活性明顯降低，24h后細(xì)胞增殖活性逐步恢復(fù)正常并略升高。
　　ALP活性在機(jī)械離心力作用下升高顯著:先給大鼠OB行離心力0×g、110×g、210×g、310×g加載5min，培養(yǎng)6h后與對(duì)照組相比，離心力可以顯著增強(qiáng)細(xì)胞ALP活性，其中2

7、10×g機(jī)械刺激加載的細(xì)胞ALP活性增加最明顯;選擇210×g的離心力刺激細(xì)胞后培養(yǎng)1h、6h、18h、24h，觀察了不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞ALP活性的變化。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比1h，6h的ALP活性增高，18h，24h的ALP活性逐步恢復(fù)正常。
　　考馬斯亮藍(lán)R250染色細(xì)胞骨架:形態(tài)學(xué)觀察表明，1h實(shí)驗(yàn)組的成骨細(xì)胞細(xì)胞骨架表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)收縮、染色變淡、稀疏、變細(xì)。去除此刺激后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，12h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞骨架逐漸恢復(fù)，表現(xiàn)為細(xì)胞骨架染色顏色加

8、深，放射狀應(yīng)力纖維增多、增粗，兩組間差異隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減小，24h的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間未見(jiàn)明顯差異。
　　3.機(jī)械離心力作用下大鼠OB的Runx2、OPN及ColⅠ mRNA的表達(dá)變化
　　利用熒光定量PCR對(duì)Runx2 mRNA表達(dá)的水平進(jìn)行了測(cè)定，細(xì)胞加力后發(fā)現(xiàn)1h的Runx2 mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照比較顯著增加(P＜0.05)，6h后其表達(dá)水平逐漸穩(wěn)定，恢復(fù)到未加力水平，18h、24h無(wú)明顯差異。阻斷BMP信號(hào)通路結(jié)果

9、顯示，Runx2 mRNA表達(dá)在D組較B組明顯增高(P＜0.05)，C組比D組明顯降低(P＜0.05）;A、C組與B組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　OPN mRNA及ColⅠ mRNA的表達(dá)變化:與空白對(duì)照組相比1h、6h時(shí)間點(diǎn)OPN mRNA及ColⅠ mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比均升高，但6h后其水平逐漸回落至未加力水平，18h、24h的時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比未檢測(cè)到顯著的變化點(diǎn)。
　　[結(jié)論]
　　1.機(jī)械離