CNTF基因眼內(nèi)轉(zhuǎn)移治療大鼠視神經(jīng)損傷的實驗研究.pdf

1、視神經(jīng)(opticnerve，ON)主要由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinalganglioncells，RGCs)的軸突組成。視神經(jīng)屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，損傷后缺乏有效的治療手段。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為中樞神經(jīng)受損后不能再生。近年的研究表明，損傷的RGCs仍具有再生能力。 補充外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophicfactors，NTFs)是能夠促進成年哺乳動物損傷RGCs存活和軸突再生的一種有效方法。最近Cui等研究表明，在眾多因子中，

2、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(Ciliaryneurotrophicfactor，CNTF)是唯一能有效促進成年倉鼠RGCs再生的神經(jīng)營養(yǎng)因子，因此，補充外源性CNTF將可能是臨床治療視神經(jīng)損傷的一個新途徑。 早在1991年，Stockli等的研究曾表明，正常視神經(jīng)中CNTFmRNA的表達(dá)水平較高，而在視網(wǎng)膜未見表達(dá)。2001年，Chun等通過免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，正常視網(wǎng)膜CNTF蛋白表達(dá)主要局限在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。而Walsh等通過免疫組化技術(shù)

3、，采用高分辨率共聚焦顯微鏡觀察到，CNTF在正常大鼠視網(wǎng)膜的Muller細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞均有少量表達(dá)，并且除了在胞體表達(dá)外，還可沿膠質(zhì)細(xì)胞的突起呈顆粒樣分布。在視網(wǎng)膜的神經(jīng)元未檢測到表達(dá)。國內(nèi)鄒倩等通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和Westernblotting檢測發(fā)現(xiàn)，正常視網(wǎng)膜中存在CNTFmRNA和蛋白的表達(dá)。由以上可見，目前對于CNTFmRNA在視網(wǎng)膜的表達(dá)和定位，多家的研究結(jié)果尚不盡一致。 玻璃體內(nèi)單次注射CNTF可以延遲由于

4、視神經(jīng)損傷所致的RGCs變性死亡，但作用時間短暫。如果眼內(nèi)重復(fù)注射，雖可延長作用時限，但會出現(xiàn)后囊下白內(nèi)障和視網(wǎng)膜皺褶等并發(fā)癥。 隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，有效的轉(zhuǎn)基因方法為治療視神經(jīng)損傷提供了新的選擇。 復(fù)制缺陷的重組腺病毒(adenovirus，Ad)載體是目前已經(jīng)應(yīng)用于基因眼內(nèi)轉(zhuǎn)移的有效病毒載體。針對視神經(jīng)橫斷傷動物模型的研究表明，將Ad-CNTF注入玻璃體內(nèi)，可有效延長CNTF的神經(jīng)保護作用。但視神經(jīng)鉗夾傷模型更接

5、近臨床情況。Ad-CNTF眼內(nèi)注射對視神經(jīng)鉗夾傷后損傷RGCs保護作用的研究未見報道。 目的：采用原位雜交組織化學(xué)技術(shù)，檢測CNTFmRNA在正常視網(wǎng)膜的表達(dá)定位；采用基因治療方法，通過視神經(jīng)鉗夾傷大鼠模型，研究玻璃體內(nèi)注射Ad-CNTF對RGCs的神經(jīng)保護作用。 方法：1、采用原位雜交技術(shù)觀察正常視網(wǎng)膜和視神經(jīng)CNTFmRNA的表達(dá)定位。 2、擴增、純化重組腺病毒載體后，通過組織化學(xué)染色，觀察重組腺病毒攜帶的目

6、的基因表達(dá)情況。 3、利用視神經(jīng)鉗夾傷模型，采用熒光金(Fluoro-gold，F(xiàn)G)逆行標(biāo)記RGCs進行定量檢測；應(yīng)用閃光視覺誘發(fā)電位(flashvisualevokedpotential，F(xiàn)-VEP)，觀察Ad-CNTF眼內(nèi)轉(zhuǎn)染對損傷RGCs的保護作用。 結(jié)果：1、原位雜交結(jié)果證實，CNTFmRNA在正常視神經(jīng)中廣泛表達(dá)；在正常視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞胞體所在的內(nèi)核層存在陽性表達(dá)。 2、X-gal染色結(jié)果表明，

7、Ad-LacZ可以在轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，順利表達(dá)攜帶的外源基因，可作為下一步在體實驗的對照病毒；免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測Ad-CNTF的眼內(nèi)表達(dá)，結(jié)果表明，Ad-CNTF眼內(nèi)注射后，視網(wǎng)膜的CNTF陽性表達(dá)明顯增多，陽性細(xì)胞在視網(wǎng)膜分布更廣泛，陽性信號強度增加，表達(dá)時限可長達(dá)28d。 3、應(yīng)用視神經(jīng)鉗夾傷模型，通過眼內(nèi)注射的給藥方式，采用熒光金逆行示蹤標(biāo)記RGCs進行定量檢測，結(jié)果表明，在傷后28d，Ad-CNTF處理組的標(biāo)記RGC

8、s數(shù)量明顯高于其他對照組。F-VEP檢測結(jié)果表明，Ad-CNTF處理組的P1波振幅的恢復(fù)，明顯好于其他對照組。 結(jié)論：我們的結(jié)果顯示：CNTFmRNA在正常視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞胞體所在的內(nèi)核層可見陽性表達(dá)。Ad-CNTF眼內(nèi)注射后，視網(wǎng)膜的CNTF陽性表達(dá)明顯增多，并且表達(dá)陽性細(xì)胞在視網(wǎng)膜分布更廣泛，陽性信號強度增加，表達(dá)時限可長達(dá)至少28d。Ad-CNTF在視神經(jīng)鉗夾傷大鼠眼內(nèi)注射后，對損傷RGCs具有明顯的神經(jīng)保護作用，效