多因素干預(yù)促進(jìn)視神經(jīng)再生的實(shí)驗(yàn)研究及視神經(jīng)缺血模型的建立.pdf

1、青光眼、外傷性、缺血性視神經(jīng)病變、視神經(jīng)炎等是目前世界范圍內(nèi)的主要致盲性眼病，臨床上尚無(wú)根治這類疾病的方法，最根本的原因就在于視神經(jīng)軸突缺乏有效的再生能力，損傷后很難修復(fù)。如何有效的保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)元，促進(jìn)其軸突再生，維持并改善視功能，是目前眼科乃至神經(jīng)科學(xué)亟待解決的難題。本研究一方面在目前視神經(jīng)再生研究的基礎(chǔ)上，聯(lián)合拮抗多種抑制損傷軸突再生的內(nèi)在、外在因素，從而更有效的促進(jìn)了損傷軸突再生;另一方面，建立了新型大鼠后部缺血性視神經(jīng)病變的動(dòng)

2、物模型，為深入研究該疾病奠定了基礎(chǔ)亦為視神經(jīng)再生的研究提供了新的且更符合生理?yè)p傷過(guò)程的視神經(jīng)病變模型。
　　第一部分聯(lián)合拮抗多種抑制軸突生長(zhǎng)的內(nèi)在和外在因素促進(jìn)損傷視神經(jīng)軸突再生
　　目的:視神經(jīng)軸突損傷后再生能力受到眾多外在和內(nèi)在因素的共同調(diào)控。本研究旨在通過(guò)聯(lián)合干預(yù)多種抑制軸突生長(zhǎng)的內(nèi)、外在因素，促進(jìn)損傷視神經(jīng)軸突再生。
　　方法:成年大鼠玻璃體腔注射多種AAV8 Y733F-shRNA病毒下調(diào)RGCs內(nèi)KLF9、

3、KLF13、KLF16、KLF2、KLF5、KLF15或PTEN的表達(dá)。AAV2-Cre玻璃體腔注射分別敲除PTENfl/fl小鼠、KLF4fl/fl小鼠以及PTENfl/fl&KLF4fl/fl小鼠RGCs內(nèi)PTEN和/或KLF4基因，并且通過(guò)玻璃體腔注射AAV2-C3抑制RGCs內(nèi)RhoA的活性，拮抗微環(huán)境中多種抑制損傷軸突再生的因子。熒光金上丘逆標(biāo)RGCs，視網(wǎng)膜鋪片計(jì)數(shù)比較視神經(jīng)損傷后各組RGCs存活率。熒光霍亂毒素B亞單位順行

4、標(biāo)記再生軸突，視神經(jīng)縱行切片在損傷位點(diǎn)后不同距離計(jì)數(shù)再生軸突數(shù)量。
　　結(jié)果:與對(duì)照組相比，同時(shí)下調(diào)RGCs內(nèi)KLF2、KLF5和KLF15的表達(dá)后，能夠顯著提高RGCs的存活率達(dá)50％以上。KLF9、KLF13和KLF16同時(shí)下調(diào)組與PTEN下調(diào)組RGCs也顯示出了與KLF2、5、15下調(diào)組相似的保護(hù)作用，并且各組再生軸突數(shù)量亦較對(duì)照組顯著增多，但再生軸突大部分局限在距離挫傷位點(diǎn)1 mm以內(nèi)。條件性敲除小鼠RGCs內(nèi)PTEN基因

5、，能夠顯著促進(jìn)視神經(jīng)再生，而KLF4的條件性敲除卻對(duì)損傷視神經(jīng)軸突再生無(wú)明顯的促進(jìn)作用，且PTEN與KLF4雙基因敲除對(duì)軸突的促進(jìn)作用與PTEN單基因敲除相似。聯(lián)合應(yīng)用C3阻斷RhoA的活性后，各組軸突再生的數(shù)量和長(zhǎng)度均有所增加，尤其以PTEN的敲除和C3聯(lián)合應(yīng)用組再生軸突的數(shù)量最多，并且最長(zhǎng)的再生軸突能夠延伸到挫傷位點(diǎn)后4mm。
　　結(jié)論:聯(lián)合下調(diào)KLFs家族多種抑制RGCs軸突生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)視神經(jīng)損傷后RGCs有保護(hù)作用并且

6、能在一定程度上促進(jìn)損傷視神經(jīng)軸突的再生。與KLF4發(fā)育性敲除不同，成年小鼠條件性敲除RGCs內(nèi)KLF4并不能促進(jìn)損傷視神經(jīng)軸突再生。而同時(shí)拮抗軸突再生的外在抑制因素（C3的應(yīng)用）和提高RGCs軸突自身的生長(zhǎng)能力（PTEN的敲除）則能夠更有效的促進(jìn)損傷視神經(jīng)軸突的再生。
　　第二部分新型大鼠后部缺血性視神經(jīng)病變模型的建立
　　目的:建立大鼠后部缺血性視神經(jīng)病變的動(dòng)物模型，并且觀察視網(wǎng)膜和視神經(jīng)在該動(dòng)物模型中的病理生理改變以及神

7、經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)視神經(jīng)缺血性病變后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　方法:通過(guò)光化學(xué)反應(yīng)誘導(dǎo)缺血性損傷(Photochemical-induced ischemia)建立大鼠后部缺血性視神經(jīng)病變的動(dòng)物模型。高分子量熒光右旋糖苷心臟灌注觀察視網(wǎng)膜、視神經(jīng)的血供情況。損傷后不同時(shí)點(diǎn)視神經(jīng)切片，HE染色觀察損傷部位病理改變，免疫組化染色觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的活化情況。上丘逆標(biāo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察損傷后RGCs死亡的時(shí)間

8、和空間分布，以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)RGCs的保護(hù)作用。
　　結(jié)果:視神經(jīng)缺血損傷后，損傷局部血管滲漏，組織水腫并最終導(dǎo)致軸突空泡樣變性。缺血灶局部星形膠質(zhì)細(xì)胞丟失而病灶周邊部則表現(xiàn)為肥大。小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞首先在損傷局部活化，隨后遷移到遠(yuǎn)端視神經(jīng)乃至視交叉部位。缺血損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞隨著時(shí)間的推移逐漸減少，在損傷后1周、2周和3周分別減少23％，50％和70％，并且不同品系大鼠RGCs減少的空間分布不同，或?yàn)槿W(wǎng)膜的廣泛減少或局

9、限于上方視網(wǎng)膜，與軸突在網(wǎng)膜內(nèi)的空間分布不同有關(guān)。BDNF和CNTF的多次應(yīng)用能夠有效的保護(hù)RGCs，至損傷后3周，能提高RGCs存活率達(dá)40％以上。
　　結(jié)論:我們通過(guò)PCI方法成功建立了大鼠后部缺血性視神經(jīng)病變的動(dòng)物模型，此模型中視網(wǎng)膜及視神經(jīng)在缺血損傷后所表現(xiàn)出的病理生理改變與臨床PION病人的病變過(guò)程很相似。這一大鼠后部缺血性視神經(jīng)病變模型不僅為進(jìn)一步深入研究PION疾病乃至其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血性疾病的發(fā)病機(jī)理、分子生物學(xué)