腺病毒CNHK200-hEndostatin的質(zhì)量控制及其大規(guī)模擴(kuò)增、純化的初步研究.pdf

1、基因治療的基本原理是將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^(guò)一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病的目的。 為此，本研究構(gòu)建了一種能腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性復(fù)制且高效表達(dá)人內(nèi)皮抑素的基因一病毒載體系統(tǒng)，利用病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖及復(fù)制，從而高效表達(dá)人內(nèi)皮抑素。這一系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)研究中被證實(shí)對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，具有很好的臨床應(yīng)用前景。 由于細(xì)胞的質(zhì)量控制方法在以往的生物制品生產(chǎn)研究中已經(jīng)趨

2、于成熟，所以本課題中討論的是對(duì)腺病毒本身進(jìn)行質(zhì)量控制所需要的方法的建立。 重組腺病毒產(chǎn)品CNHK200-hEndo是由載體DNA即腺病毒DNA和治療基因即人內(nèi)皮抑素基因所構(gòu)成，其基本質(zhì)量指標(biāo)包括鑒別實(shí)驗(yàn)和效力實(shí)驗(yàn)，是從腺病毒產(chǎn)品的鑒定、治療基因的存在、表達(dá)和生物學(xué)活性四個(gè)方面進(jìn)行檢測(cè)。鑒別實(shí)驗(yàn)包括限制性內(nèi)切酶圖譜分析和治療基因的 PCR 鑒定，效力實(shí)驗(yàn)包括基因表達(dá)檢測(cè)和生物學(xué)活性檢測(cè)，是進(jìn)一步驗(yàn)證存在于產(chǎn)品中的目的基因經(jīng)腺病毒載

3、體介導(dǎo)后是否可在靶細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白以及表達(dá)的目的蛋白是否具有生物學(xué)活性。 在本研究中，用SDS-PAGE方法對(duì)腺病毒進(jìn)行蛋白鑒定，用限制性內(nèi)切酶圖譜分析的方法對(duì)腺病毒進(jìn)行DNA鑒定，結(jié)果表明樣品均符合目的腺病毒的要求。同時(shí)，應(yīng)用PCR的方法來(lái)鑒定內(nèi)皮抑素基因是否存在于該腺病毒DNA中，對(duì)于其表達(dá)情況和生物活性則使用ELISA的方法，結(jié)果表明該基因存在于該腺病毒DNA中并在細(xì)胞中能夠成功表達(dá)，具有生物活性。 本研究建立了

4、用陰離子交換層析方法檢測(cè)病毒顆粒數(shù)的方法，不僅對(duì)于樣品量的要求低，而且即使樣品中混有蛋白和DNA雜質(zhì)也能得到有效的區(qū)分，使病毒顆粒數(shù)的計(jì)算更為準(zhǔn)確和穩(wěn)定。 本研究采用建立的HPLC方法對(duì)純化的腺病毒CNK200-hEndo進(jìn)行純度檢測(cè)，結(jié)果達(dá)到99％，完全達(dá)到臨床應(yīng)用的要求。我們用PCR方法對(duì)野生型腺病毒進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增腺病毒CNHK200-hEndo中部分缺失而野生型腺病毒中仍然保存的E1B區(qū)。結(jié)果表明，這種方法完全可以用于檢測(cè)

5、野生型腺病毒基因組的存在，而進(jìn)行檢測(cè)的腺病毒產(chǎn)品CNHK200-hEndo并未檢測(cè)到野生型腺病毒。殘余宿主DNA含量和殘余牛血清蛋白含量是腺病毒雜質(zhì)檢測(cè)中重要的兩項(xiàng)，對(duì)于未來(lái)臨床應(yīng)用的安全性具有重要意義。 在本研究中應(yīng)用地高辛標(biāo)記的探針對(duì)腺病毒樣品進(jìn)行線雜交，其檢測(cè)敏感度高，可以檢測(cè)到1pg/ml的DNA含量，但是易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性，仍需要進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整。殘余牛血清蛋白含量測(cè)定是應(yīng)用中國(guó)藥品生物制品檢定所提供的常規(guī)檢測(cè)試

6、劑和方法，方法簡(jiǎn)單，易于掌握，結(jié)果穩(wěn)定，可用于腺病毒的質(zhì)量控制。 本研究參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)以及結(jié)合自己的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，將生產(chǎn)腺病毒的培養(yǎng)基定為含2％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。在應(yīng)用反應(yīng)器進(jìn)行腺病毒擴(kuò)增的過(guò)程中，由于細(xì)胞生長(zhǎng)的情況將直接決定病毒的產(chǎn)量，因此，細(xì)胞培養(yǎng)載體的選擇也是十分重要的。293細(xì)胞的特點(diǎn)是貼壁的能力較差，易脫落和結(jié)團(tuán)，由于固定床式反應(yīng)器采用灌注培養(yǎng)方式而不需要細(xì)胞截流系統(tǒng)，貼壁能力差的細(xì)胞也能在該系統(tǒng)中很好地培養(yǎng)。我們

7、用此種方式培養(yǎng)293細(xì)胞，采用灌注培養(yǎng)，細(xì)胞接種后貼壁很快，接種1小時(shí)后細(xì)胞貼壁率可達(dá)98％以上。整個(gè)培養(yǎng)周期約7-10天，細(xì)胞增殖可達(dá)25-50倍。 腺病毒的產(chǎn)量不僅取決于宿主細(xì)胞的數(shù)量和生長(zhǎng)狀況，其感染條件也是一個(gè)非常重要的因素。在感染條件中，病毒 MOI (Multiplity OfInfection，感染量)是一個(gè)最重要的因素。在灌注培養(yǎng)中，很重要的一個(gè)參數(shù)是灌注量的確定。由于病毒擴(kuò)增是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，細(xì)胞在感染病毒后的

8、一系列代謝變化將改變常規(guī)生長(zhǎng)狀態(tài)下對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求量。通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)液中葡萄糖的含量來(lái)跟蹤細(xì)胞的代謝變化，并通過(guò)維持不同水平的葡萄糖含量來(lái)研究灌注量對(duì)于病毒擴(kuò)增的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有在合適的灌注量情況下，維持合適的葡萄糖濃度才能得到較高產(chǎn)量的腺病毒。 此外，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定了生物反應(yīng)器擴(kuò)增腺病毒所涉及的其它參數(shù)，如載體量、攪拌轉(zhuǎn)速、感染時(shí)間、病毒上清的過(guò)濾孔徑等，基本建立了腺病毒通過(guò)反應(yīng)器擴(kuò)增的方法。按照上述方法，擴(kuò)增了三批CNHK200

9、-hEndo腺病毒，結(jié)果總產(chǎn)量均達(dá)到10<'15>vp以上，比活性也基本符合要求，能夠滿足臨床試驗(yàn)的需要量。腺病毒的純化，一直是用CsCl梯度超離心的方法。首先選擇了DEAE Sepharose F.F.、SOURCE 30 Q和Q Sepharose XL三種不同材質(zhì)的陰離子交換層析的填料進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)采用相同的純化參數(shù)，比較各填料在純化腺病毒過(guò)程中的回收率以及最終腺病毒樣品的純度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純度結(jié)果最好的是SOURCE 30 Q，達(dá)

10、到了85％；回收率最好的也是SOURCE 30 Q，達(dá)到了80％，因此使用SOURCE 30 Q作為進(jìn)一步研究的介質(zhì)。 本文應(yīng)用SOURCE 30Q對(duì)腺病毒進(jìn)行純化，建立了以下純化參數(shù)： (1).填料體積為300ml； (2).平衡液為20mMTris、150mMNaCl、2mM MgCl2、PH7.5，洗脫液為20mM Tris、1M NaCl、2mM MgCl2、PH7.5； (3).平衡和上樣、洗脫

11、流速均為10ml/min(4)洗脫程序?yàn)?0個(gè)柱體積線性梯度洗脫。按照上述參數(shù)純化經(jīng)超濾濃縮和純化的腺病毒樣品，能夠很好的分離腺病毒、蛋白雜質(zhì)和核酸雜質(zhì)，收集到的腺病毒峰中雜質(zhì)含量極微，經(jīng)HPLC分析腺病毒純度可以達(dá)到99.7％，回收率也達(dá)到80％以上。 同時(shí)，通過(guò)對(duì)反應(yīng)器擴(kuò)增的病毒上清的純化過(guò)程，發(fā)現(xiàn)在300ml體積填料的情況下，其腺病毒載量可以達(dá)到2×10<'14>vp，這樣的載量已經(jīng)基本能滿足大規(guī)模制備腺病毒的需要。此外，

12、腺病毒保存溶液的研究也是一個(gè)重要課題。病毒顆粒必須保持它們的結(jié)構(gòu)完整性以保持它們的感染性和生物活性，病毒載體的結(jié)構(gòu)完整性經(jīng)常在制劑的過(guò)程中損壞，這妨礙了它作為基因治療載體的用途。本文制訂了三種腺病毒保存液配方，通過(guò)穩(wěn)定性試驗(yàn)考察腺病毒在這些保存液中的穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腺病毒在4℃條件下也能較長(zhǎng)期地保存，在配方A和配方C中腺病毒可以在6個(gè)月以內(nèi)一直保持其數(shù)量和活性。 總的來(lái)說(shuō)，應(yīng)用超濾的方法可以將病毒原液中的較小的蛋白分子和雜質(zhì)初