腺相關病毒載體大規(guī)模生產系統(tǒng)的建立及其機制研究.pdf

1、腺相關病毒(adeno-associatedvirus，AAV)是一種非致病性基因治療病毒載體。流行病學研究發(fā)現(xiàn)80％的人群感染過AAV病毒而至今尚未發(fā)現(xiàn)任何跟AAV相關的疾病。重組AAV載體(rAAV)刪除了全部病毒基因組，只保留了兩端具有調控作用的反向末端重復序列(InvertedTerminalRepeats，ITR)，因而使其具有更好的安全性。另外，AAV屬于細小病毒科，其病毒顆粒非常小，物理性質穩(wěn)定，容易存儲而不易失活，因而具

2、備生物制品成藥的優(yōu)勢特征。AAV病毒載體在在許多疾病的治療中都展現(xiàn)出了很好的效果，2009年Science評選的“十大科技進展”中就有AAV在治療黑朦癥上獲得的巨大成功。NewEnglJMed報道用AAV治療先天性失明的黑朦癥患者，治療者即恢復了視覺，可像正常人一樣做體育運動，且在后期臨床追蹤中未有任何嚴重不良反應。Nature、NatMed等雜志也多次報道用AAV表達抗體治療HIV，可完全消除小鼠和猴子體內的HIV病毒。除此之外，AA

3、V在神經系統(tǒng)疾病、代謝疾病以及腫瘤等應用中都有著較好的表現(xiàn)。因而，AAV作為疾病治療的運輸載體越來越受到全世界的廣泛關注。
　　 全世界當前利用AAV正在進行39項臨床試驗，其中28項在美國，7項在歐洲，2項在中東地區(qū)，印度和非洲各有1項。而在南美洲、澳洲以及其他科技發(fā)達地區(qū)如加拿大、新加坡、日本等許多地方都還沒有開展相關的臨床試驗。限制AAV在其他地區(qū)開展臨床試驗的一個非常重要的因素就是AAV病毒包裝難度較大，尤其是受限于大規(guī)

4、模生產，使得AAV在大型動物實驗以及臨床試驗上的應用一直難以開展，即便是在美國也還沒有關于AAV大規(guī)模生產的一個標準方案。因而，建立AAV大規(guī)模生產技術對于加速AAV載體的應用研究和占據相關領域研究的制高點具有非常重要的意義。傳統(tǒng)AAV生產是用三質粒共轉染HEK293細胞，如果要生產出1014vg的病毒，就需要反復轉染共達5000多個175cm2的Flask培養(yǎng)瓶，這對于操作技術以及人力物力上而言都是極大的限制。為此，國際上一直在尋求能

5、夠大量生產AAV的方式，建立了包括Ad/AAV，HSV/AAV，生產細胞株以及昆蟲細胞-桿狀病毒表達載體系統(tǒng)在內的多種生產方式。其中，昆蟲細胞桿-狀病毒表達載體系統(tǒng)(InsectCell-BaculovirusExpressionVectorSystem，IC-BEVS)生產AAV在近些年引起了廣泛的關注，是一種非常有潛力的生產系統(tǒng)。雖然在哺乳動物細胞中生產AAV已經廣泛研究，但是昆蟲細胞中AAV包裝組份的定位和相互作用幾乎一無所知，這

6、些定位和相互作用是其基因組復制、外殼組裝和基因組包裝的關鍵。本研究著重建立基于昆蟲細胞-桿狀病毒表達載體系統(tǒng)的大規(guī)?？删€性放大的AAV新穎生產和純化技術，并在此基礎上首次對1，2，8，9四種血清型AAV病毒在昆蟲細胞中的重組過程進行系統(tǒng)化的動態(tài)對比研究。
　　 第一部分：基于IC-BEV系統(tǒng)的腺相關病毒生產體系的建立
　　 目的：構建基于pFBD骨架載體的包裝AAV所需的重組桿狀病毒載體，重組生產1，2，8，9型AAV。

7、
　　 方法：(1)以pFBD載體為骨架，構建攜帶有AAV2的Rep基因以及各血清型Cap基因的重組桿狀病毒轉移載體pABP1，2，8或9，在Rep基因及Cap基因的特定位點引入Intron-ph啟動子以啟動Rep和Cap基因在昆蟲細胞中的表達；(2)以pFBD載體為骨架，構建攜帶有AAV2ITR表達框的重組桿狀病毒轉移載體pABVN-hCMV-EGFP和pABVN-hCMV-H794；(3)將上述pABP1，2，8，9以及pA

8、BVN-hCMV-EGFP和pABVN-hCMV-H794總共六個載體分別與DH10BacTM細菌轉座重組，藍白斑篩選出相應的重組桿狀病毒載體pABPM1，2，8，9以及pABVNM-hCMV-EGFP和pABVNM-hCMV-H794；(4)包裝重組桿狀病毒ABPM1，2，8，9以及ABVNM-hCMV-EGFP和ABVNM-hCMV-H794；(5)重組桿狀病毒ABPM1，2，8，9分別與ABVNM-hCMV-EGFP或ABVNM-

9、hCMV-H794兩兩重組生產rAAV1-hCMV-EGFP或H794，rAAV2-hCMV-EGFP或H794，rAAV8-hCMV-EGFP或H794，rAAV9-hCMV-EGFP或H794；(6)RT-PCR檢測相應的病毒滴度，WesternBlot檢測Rep和Cap蛋白的表達，細胞實驗驗證rAAV的功能。
　　 結果：成功構建了pABP1，2，8，9以及pABVN-hCMV-EGFP和pABVN-hCMV-H794載體

10、，并通過轉座重組及病毒包裝獲得相應的重組桿狀病毒；成功重組出1，2，8，9四型AAV病毒；RT-PCR、WesternBlot以及細胞感染實驗分別成功測定了病毒滴度、蛋白表達和驗證了病毒功能。
　　 結論：成功建立以昆蟲細胞-桿狀病毒表達載體系統(tǒng)(IC-BEVS)為基礎腺相關病毒生產體系。
　　 第二部分：腺相關病毒載體的大規(guī)模生產、純化及鑒定
　　 目的：在已建立基于IC-BEV系統(tǒng)的腺相關病毒生產體系的基礎上

11、，放大AAV生產規(guī)模，建立相適應的可線性放大的大規(guī)模生產和純化技術，并建立對應的病毒鑒定和評價體系。
　　 方法：采用BD公司的500mlFalcon培養(yǎng)瓶在恒溫培養(yǎng)振蕩器中重組生產rAAV1，2，8和9，比較研究多種細胞裂解方案、緩沖液體系、離子濃度以及層析緩沖液pH值等條件并進行優(yōu)化，通過AKTAPurifier10蛋白純化儀用AVB親和層析柱分離純化rAAV，并通過RT-PCR測定滴度、SilverStaining測定純度

12、、透射電鏡觀察計算病毒實心顆粒與空殼顆粒的比例，細胞試驗驗證純化病毒的功能。
　　 結果：建立了基于IC-BEVs系統(tǒng)的AAV大規(guī)模生產和純化技術，目前優(yōu)化的條件適合于rAAv1，2和8的分離純化，每100ml培養(yǎng)體系可生產高達1013VG的病毒，單次生產即可獲得1014VG的產量，相比傳統(tǒng)方式需轉染5000個175cm2瓶子的細胞大大提高了效率，得到的病毒純度超過95％，實心病毒顆粒占85％左右，病毒具有較好的感染能力。

13、>　　 結論：我們建立基于IC-BEVS的AAV大規(guī)模生產和純化技術從產量和純度上評價都達到了世界先進水平，為AAV產業(yè)化生產和應用AAV開展相關的研究奠定了基礎。9型AAV的純化條件還需進一步探索。
　　 第三部分：IC-BEV系統(tǒng)中生產AAV時的動態(tài)機制研究
　　 目的：哺乳動物細胞中生產AAV已經得到廣泛深入的研究，但是AAV在昆蟲細胞中的包裝生產過程幾乎一無所知。我們首次系統(tǒng)的比較研究了rAAV1，2，8，9四

14、種血清型AAV病毒在昆蟲細胞中組裝的動態(tài)機制，為進一步深入理解和優(yōu)化基于IC-BEVS的AAV大規(guī)模生產和純化技術提供線索。
　　 方法：用抗Rep蛋白，抗各型Cap蛋白，抗rAAV1和rAAV2整個病毒顆粒以及抗桿狀病毒表面糖蛋白gp64的抗體，分別于12，24，48，72和96小時通過免疫熒光技術研究在昆蟲細胞中組裝AAV病毒時各組分的動態(tài)作用機制。同時，通過透射電鏡觀察昆蟲細胞中重組生產AAV病毒時的細胞結構變化。

15、　　 結果：在昆蟲細胞中Rep蛋白表達后迅速進入核內，隨時間推進濃度逐漸提高并呈簇分布，Cap蛋白表達后的入核速度相比而言要慢些，但最終也進入核內并與Rep蛋白的分布密切相關，其中2型和9型Cap與Rep蛋白的相互作用更為明顯。各型AAV在核內組裝，組裝部位與桿狀病毒基質以及纖維結構密切相關，組裝的AAV主要分布在核周的環(huán)區(qū)，環(huán)區(qū)也是大量桿狀病毒積聚的地方，免疫熒光顯示Rep和Cap蛋白在此處發(fā)生相互作用。
　　 結論：Rep

16、蛋白和Cap蛋白于桿狀病毒特有的病毒基質外的環(huán)區(qū)組裝成rAAV，Rep蛋白與各型Cap蛋白之間可能存在相互作用，桿狀病毒與纖維結構以及AAV顆粒的分布密切相關。AAV在Sf9細胞中的組裝部位似乎不在哺乳動物細胞中報道的核仁區(qū)域。Rep、Cap以及AAV和桿狀病毒等在Sf9細胞中的精細作用機制還需要進一步的研究來確證。
　　 綜上所述，我們成功建立了基于IC-BEVS的多血清型AAV的大規(guī)模生產和純化技術平臺，其產量(1013VG