反義轉(zhuǎn)化生長因子受體與反義基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子聯(lián)合作用對肝纖維化的影響.pdf

1、背景：在我國肝纖維化發(fā)生率高,是肝硬化發(fā)展的必經(jīng)環(huán)節(jié)。目前研究認(rèn)為肝纖維化屬于可逆性病變,因此阻止和延緩肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展則是治療肝硬化的關(guān)鍵。 研究發(fā)現(xiàn)在致肝纖維化的細(xì)胞因子中最重要是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β),其致纖信號傳導(dǎo)通路已闡明：首先活化了的TGF-β與II型TGF-β受體(TβRII)結(jié)合并使之磷酸化而具有激酶活性；與TGF-β結(jié)合的TβRII再結(jié)合I型TGF-β受體(TBRI)形成I、II型受體復(fù)合物,并使Tβ

2、RI磷酸化具有激酶活性；最后,激活的TβRI激活酶磷酸化其特殊的受體Smads(R-Smads),從而調(diào)節(jié)肝星形細(xì)胞(HSC)的轉(zhuǎn)化和ECM的合成、降解。即TGF-β發(fā)揮作用必須借助其在細(xì)胞膜上的跨膜受體TβRI和TβRII。故從理論上,可推測選擇性抑制TβRI的表達(dá),應(yīng)可影響TGF-β信號傳導(dǎo),從而抑制TGF-β的促纖維化作用。 在正常肝臟中,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)處于動態(tài)平衡的狀

3、態(tài),維持了膠原的產(chǎn)生與降解之間的平衡。當(dāng)有損傷因子作用于肝臟,使HSC活化,打破了MMPs與TIMPs的平衡,就會導(dǎo)致膠原纖維降解的減少,致使大量的膠原在肝組織中沉積。肝內(nèi)主要存在的TIMPs有TIMP-1和TIMP-2,其中以TIMP-1表達(dá)更為顯著；主要存在的MMMPs在人類為MMP-1,在嚙齒類動物為MMP-13;TIMP-1可與MMP-1/MMP-13特異性結(jié)合,抑制其活性。故推測,抑制TIMP-1的表達(dá),可減輕TIMP-1對M

4、MP-1/MMP-13的抑制作用,增加ECM的降解,減少ECM的沉積,延緩肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。 本實驗旨在前期研究的基礎(chǔ)上,應(yīng)用分子生物學(xué)檢測技術(shù)RT-PCR和western-bloting(蛋白印跡)測定各實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠肝組織TBRI,TBRII和TIMP-1,MMP-13mRNA含量及蛋白的表達(dá),并對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行科學(xué)分析,從生物分子的角度闡述并驗證本課題,反義轉(zhuǎn)化生長因子受體與反義基質(zhì)蛋白酶抑制因子聯(lián)合作能夠有效的干預(yù)肝纖

5、維化的發(fā)生,發(fā)展。最終的目標(biāo)是運用基因治療技術(shù)尋找一種防止和延緩各種慢性肝病向肝纖硬化發(fā)展的有效方法,為今后人類肝纖維化基因治療奠定基礎(chǔ)。 材料與方法：取-80℃低溫保存的實驗大鼠肝臟：正常對照組12例,模型對照組12例、空質(zhì)粒組13例、反義TIMP-1真核表達(dá)質(zhì)粒組13例,反義TβRI治療組13例,反義TβRII治療組13例,反義TβRI+反義TIMP-1治療組13例：反義TβRII治療組+反義TIMP-1治療組13例。

6、 1.運用RT-PCR半定量檢測肝組織內(nèi)TβRImRNA、TβRIImRNA、TIMP-1mRNA、MMP-13mRNA測定。 2.western blot蛋白印記技術(shù)檢測大鼠肝組織中TβRI、TβRII、TIMP-1、MMP-13蛋白表達(dá)。 3.進(jìn)行系統(tǒng)科學(xué)數(shù)據(jù)分析,論證。 結(jié)果：與模型對照組和空質(zhì)粒組相比,反義TBRI治療組,反義TBRI+反義TIMP-1治療組、反義TIMP-1治療組、反義TβRⅡ治療組、

7、反義TβRⅡ+反義TIMP-1各治療組中的TβRI、TβRII及TIMP-1 mRNA含量及蛋白表達(dá)均有下降,各組比對均有統(tǒng)計學(xué)意義。在正常對照組與各實驗治療組之間TβRI、TβR II及TIMP-1 mRNA含量及蛋白表達(dá)均有顯著性差異；反義TβRI+反義TIMP-1治療組較反義TβRI治療組、反義TIMP-1治療組比對有統(tǒng)計學(xué)意義；反義TβRⅡ+反義TIMP-1各治療組較反義TβR II治療組,反義TIMP-1治療組比對有統(tǒng)計學(xué)意義

8、；模型對照組和空質(zhì)粒對照組之間TβRI、TBRⅡ及TIMP-1 mRNA含量及蛋白表達(dá)則無顯著差異。 結(jié)論： 1、反義TβRⅠ、TβRⅡ真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒通過阻斷TGF-β1的作用通道,減少細(xì)胞外間質(zhì)(ECM)的合成,減輕肝纖維化的發(fā)展；通過實驗也驗證了TGF-β信號通路的存在。 2、反義TβRⅠ、TβRⅡ真核細(xì)胞通過阻斷FGF-β1的作用通道,對MMP-13產(chǎn)生抑制作用,對TIMP-1的促進(jìn)作用,間接使細(xì)胞外間質(zhì)