白細(xì)胞介素12B基因多態(tài)性與早發(fā)冠心病相關(guān)性研究.pdf

1、背景：冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，簡稱冠心病(Coronary atheroscleroticheart disease CAD)，是一類嚴(yán)重影響人類身體健康的疾病。由動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的心腦血管疾病包括冠心病、腦卒中已經(jīng)成為現(xiàn)代社會中最主要致死和致殘的原因，且發(fā)病趨勢呈年輕化。早發(fā)冠心病是指發(fā)病年齡男性小于55歲，女性小于65歲的冠心病，是一種特殊類型的冠心病。近年來國內(nèi)外研究表明早發(fā)冠心病有增多的趨勢，其冠狀動(dòng)脈病變發(fā)生早或者病程發(fā)展迅

2、速，是威脅中年人身體健康的重要原因。最新統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)達(dá)國家，CAD的死亡率有所下降，但在發(fā)展中國家，包括中國，CAD的死亡率仍呈驚人的上升趨勢。據(jù)WHO估計(jì)，到2020年左右我國將會迎來CAD的流行高峰。CAD的防治仍是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。早發(fā)冠心病的相關(guān)致病基因較多，目前研究認(rèn)為炎癥是早發(fā)冠心病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，一些既與炎癥又與早發(fā)冠心病密切相關(guān)的因子已成為近年來關(guān)注的焦點(diǎn)，深入研究這些因子，無疑會為早發(fā)冠心病的防治提供新的思路。冠心

3、病的病理學(xué)說較多，包括脂質(zhì)浸潤學(xué)說、神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)說、同型半胱氨酸代謝障礙學(xué)說以及與炎癥損傷有關(guān)的血管內(nèi)膜損傷學(xué)說等。動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生由環(huán)境因素和遺傳因素共同決定，且多呈復(fù)雜性遺傳模式。通過家系定位克隆和候選基因關(guān)聯(lián)分析，已經(jīng)認(rèn)識到一些基因在動(dòng)脈粥樣硬化的過程中發(fā)揮著作用。不同的病理學(xué)說涉及的環(huán)節(jié)中，炎癥因子都是直接致病因子之一，因此研究炎癥因子與冠心病的關(guān)聯(lián)性逐漸成為熱門研究對象。對冠心病這樣的復(fù)雜疾病并不遵循孟德爾遺傳模式，它們

4、的遺傳基礎(chǔ)可能代表了多個(gè)DNA變異的累積。單核苷酸多態(tài)性是一種理解復(fù)雜疾病遺傳方式的有前途的研究手段，該方法主要檢測病例組與對照組廣泛存在的不同基因位點(diǎn)，多位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性使基因功能的表達(dá)和翻譯過程產(chǎn)生差異性，用病例組中累積的基因型頻率和對照組中比較而不是單個(gè)的突變進(jìn)行比較，尤其適用于候選基因的研究中。這種研究方法已經(jīng)成功的應(yīng)用于研究多種復(fù)雜疾病的研究。由于遺傳因素和環(huán)境因素的相互作用是疾病發(fā)生發(fā)展的共同特點(diǎn)，國外對IL-12B遺傳多

5、態(tài)性在血管病變中致病作用進(jìn)行了研究，由于人群的異質(zhì)性、地域、飲食差異等原因，在不同種族中的研究結(jié)果不盡相同。相對于基因突變，單核苷酸多態(tài)性在生物學(xué)個(gè)體中較為常見，不同基因型可能對疾病的表型有更大的影響作用，這為我們研究早發(fā)冠心病的病因提供了思路。白細(xì)胞介素12B(IL-12B)屬于炎癥因子之一，其表達(dá)的強(qiáng)弱與機(jī)體免疫力相關(guān)，參與冠心病的發(fā)生發(fā)展過程。因此，明確白細(xì)胞介素12B基因與早發(fā)冠心病的關(guān)系對于早發(fā)冠心病的預(yù)防、治療和預(yù)后有重要的

6、臨床意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。IL-12B基因位于染色體5q31-33，調(diào)控活化的巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞分泌IL-12B的一條重肽鏈p40的產(chǎn)生。IL-12B抗炎癥作用機(jī)理主要包括:通過NKT細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞起細(xì)胞毒作用;通過腫瘤壞死因子介導(dǎo)的間接清除結(jié)核桿菌作用;作用于NK細(xì)胞，產(chǎn)生內(nèi)源性IFN-γ;通過直接調(diào)理先天免疫介導(dǎo)的吞噬細(xì)胞功能或活化補(bǔ)體系統(tǒng)起間接調(diào)理作用。
　　 目的：通過使用基于家系的遺傳學(xué)研究的方法

7、比較分析中國漢族早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病先證者與其生物學(xué)父母的白細(xì)胞介素12B（IL-12B）基因多態(tài)性分布的差異，揭示基因多態(tài)性與中國漢族早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病先證者的相關(guān)關(guān)系，探索該基因多態(tài)性在早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病發(fā)病的遺傳機(jī)制中的意義，從而為早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病病因的研究和臨床藥物治療提供一定的理論依據(jù)，并為該病的基因診斷和治療提供初步的研究基礎(chǔ)。
　　 方法：在對早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者

8、及其家屬詳細(xì)和完整地說明了本次研究的內(nèi)容和意義后，獲得了自愿參加研究的口頭及書面同意。病例組為早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者。納入標(biāo)準(zhǔn):1）男性小于55歲及女性小于65歲;2）冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)為經(jīng)皮冠脈造影證實(shí)至少一支冠脈血管狹窄大于50％;3)漢族;4）本人知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):（符合以下任意一條即排除）:1）非漢族人群;2）有惡性腫瘤病史;3）嚴(yán)重肝腎功能不全;4）明確的血液系統(tǒng)疾病;5）明確的免疫性疾病等炎性疾病;6）明確的甲亢等甲

9、狀腺疾病;7）其他引起胸痛的原因如肺栓塞、心肌病、主動(dòng)脈瘤、心臟瓣膜病及充血性心力衰竭;8）先證者的父或/和母死亡或相關(guān)資料難以獲得者。對照組為患者生物學(xué)父母。納入標(biāo)準(zhǔn):1）年齡≥50歲;2）漢族;3）無嚴(yán)重軀體疾病或腦器質(zhì)性疾病;4）無自身免疫性疾病;5）無早發(fā)冠心病病史;6）本人知情同意。采取研究對象外周靜脈血5ml，以0.5mol/l的EDTA(PH8.0)100μl抗凝，室溫放置15～30分鐘后4000rpm離心15分鐘，分離并

10、棄血漿，沉淀全血細(xì)胞，-20℃冰箱凍存?zhèn)溆?。在室溫下使凍存的全血?xì)胞標(biāo)本解凍;在離心管中取100μl靜脈血，采用Chelex100法提取DNA。瓊脂糖凝膠電泳法鑒定提取的DNA。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR):將溶于1 ml TE(PH8.0)的基因組DNA0.5微升用TE(PH8.0)稀釋10倍為5μl后作為模板?？偡磻?yīng)體系25μL。4個(gè)SNP位點(diǎn)，參考文獻(xiàn)資料并采用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物。rs15677380上游引物5'

11、 TTTGTCATCCCGTCTCCTTC3'，下游引物5'CAACAAAATATCCTGTGT TAGG TAGA3';rs1203527793上游引物5'CAAAATGAAAGGT GCGGAGGA3'，下游引物5' GGGGCTAAGTAGGCTGAAAAA3';rs14050306上游引物5' CTGGCACTATCCCCCAAGTA3'，下游引物5'TTCAGTAGTGG CAGCAGTGG3';rs13726393上游引物5

12、'CATGACCTATGATTAATCTCTTCCA3'，下游引物5' CCTGTGAAGAAAAGGCCATA3'。擴(kuò)增反應(yīng)體系:采用25μl的反應(yīng)體系，該體系中含有:2×Tap PCR MasterMix12μL(產(chǎn)品組成:0.1U Tap Polymerase/μL,500μM dNTP each,20μM Tris-HCl(pH8.3),100μM KCl,3mM MgCl2),上下游引物各2μL，DNA模板4μL，雙蒸水補(bǔ)充至

13、總體積25μL。PCR混合液先經(jīng)95℃預(yù)處理5min，再經(jīng)35個(gè)循環(huán)反應(yīng)，然后延伸10mim。對擴(kuò)增產(chǎn)物酶切分型，酶切體系20μL，包括PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL，10×buffer2μL，內(nèi)切酶(rs15677380為DdeI, rs1203527793為SphI, rs14050306為Scr F I,rs13726393為Hpa I)0.2μL，雙蒸水補(bǔ)充至總量20μL。酶切產(chǎn)物在37℃孵箱中放置4h后用2.5％瓊脂糖凝膠電泳分離。其

14、中rs1203527793采用聚丙稀酰胺凝膠電泳，并采用銀染顯色。根據(jù)酶切圖譜判斷基因型。使用全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相。反應(yīng)在Perkin-Elmer9600型擴(kuò)增儀上進(jìn)行?？崭挂葝u素(FINS)、C-肽、尿微量白蛋白肌酐比測定用放射免疫分析法，HbAlC測定使用高壓液相親和層析法，空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)采用使用全自動(dòng)生化分析儀。血常規(guī)血細(xì)胞分析五分類，尿常規(guī)分析采用尿液分析儀。操作嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行

15、。胰島素抵抗指數(shù)定義為空腹血漿胰島素(mIU/L)×空腹血糖(mmol/L)/22.5。早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病病例組中，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料在病例組不同性別之間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)量資料在病例組中同一位點(diǎn)基因型之間的差異比較采用方差分析方法，病例組不同性別之間基因型和等位基因頻率的分布是否存在差異采用卡方檢驗(yàn)，以上統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者核心家系在rs1

16、5677380、rs1203527793、rs14050306、rs13726393位點(diǎn)上對病例組與對照組（病例的父母構(gòu)成的組別）分別用R語言Genetics程序包做Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn);運(yùn)用R語言Genetics程序包計(jì)算各位點(diǎn)的連鎖不平衡關(guān)系，并對數(shù)據(jù)采用MCPDT程序包(http://www.stat.osu.edu/～statgen/SOFTWARE/MC-PDT/)做TDT檢驗(yàn)，同時(shí)用FBAT1.7.3軟件

17、對數(shù)據(jù)進(jìn)行疾病與基因之間的關(guān)聯(lián)分析。各種檢驗(yàn)均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。
　　 結(jié)果：⑴病例組:共入組348例，其中男性200例，女性148例;平均年齡(44.23±4.711)歲。⑵利用R語言Genetics程序包對父母組和病例組的基因型分別進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)，病例組與父母組A/A，A/G，G/G基因型的觀察值和期望值做Hardy-Weinberg平衡定律擬合優(yōu)度檢驗(yàn):在rs13726393位點(diǎn)

18、上，父母組x2=65.28，P＜0.001，病例組x2=50.84，P＜0.001;在rs15677380位點(diǎn)上，父母組x2=32.60，P＜0.001，病例組x2=1.52，P=0.233;在rs14050306位點(diǎn)上，父母組x2=26.59，P＜0.001，病例組x2=61.50，P＜0.001;在rs1203527793位點(diǎn)上，父母組x2=1.16，P=0.2928，病例組x2=41.90，P＜0.001。發(fā)現(xiàn)父母組中rs1203

19、527793位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡定律，在病例組中rs15677380位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡定律。⑶所選rs13726393基因SNP位點(diǎn)存在能被Hpa I內(nèi)切酶所識別的A和G二態(tài)性， rs15677380基因SNP位點(diǎn)存在能被Dde I內(nèi)切酶所識別的A和G二態(tài)性，rs14050306基因SNP位點(diǎn)存在能被Scr F I內(nèi)切酶所識別的A和G二態(tài)性，rs1203527793基因SNP位點(diǎn)存在能被SphI

20、內(nèi)切酶所識別的A和G二態(tài)性。⑷病例組不同性別之間在4個(gè)SNP位點(diǎn)上基因型和等位基因分布的差異比較進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，只有rs13726393 SNP位點(diǎn)上不同性別組之間基因型和等位基因頻率分布無顯著差異，rs15677380 SNP位點(diǎn)上不同性別組之間等位基因頻率分布無顯著差異，其余SNP位點(diǎn)上不同性別組之間基因型和等位基因頻率分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，在rs13726393位點(diǎn)上，男女基因型頻率分布x2=0.96，P=0.627，男女等

21、位基因頻率分布x2=0.29，P=0.591;在rs15677380位點(diǎn)上，男女基因型頻率分布x2=43.60，P＜0.001，男女等位基因頻率分布x2=0.06，p=0.806;在rs14050306位點(diǎn)上，男女基因型頻率分布x2=24.07，P＜0.001)，男女等位基因頻率分布x2=26.44，P＜0.001;在rs1203527793位點(diǎn)上，男女基因型頻率分布x2=25.70，P＜0.001，男女等位基因頻率分布x2=11.45

22、，P=0.001。⑸使用R語言Genetics程序包對四個(gè)位點(diǎn)分別進(jìn)行兩位點(diǎn)連鎖不平衡分析。各位點(diǎn)在染色體上的位置如下:rs15677380為6065277，rs1203527793為61120383, rs14050306為64110562, rs13726393為6610754。rs15677380-rs1203527793的連鎖不平衡分析結(jié)果為x2=47.57，P＜0.001。rs15677380-rs14050306的連鎖不平衡

23、分析結(jié)果為x2=1.73，P=0.189。rs15677380-rs13726393的連鎖不平衡分析結(jié)果為x2=3.49，P=0.060。rs1203527793-rs14050306的連鎖不平衡分析結(jié)果為x2=6.13，P=0.013。rs1203527793-rs13726393的連鎖不平衡分析結(jié)果為x2=1.30，P=0.254。rs14050306-rs13726393的連鎖不平衡分析結(jié)果為x2=0.22，P=0.642。結(jié)果顯

24、示:rs15677380-rs1203527793、rs1203527793-rs14050306位點(diǎn)間連鎖不平衡，其余位點(diǎn)之間連鎖平衡。⑹rs13726393等位基因與早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病相關(guān)聯(lián)(P=0.002)，其中等位基因A為危險(xiǎn)因素(Z=3.05)，G是保護(hù)因素(Z=-3.05);rs14050306與早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病有關(guān)聯(lián)(P=0.002);其中等位基因A為危險(xiǎn)因素(Z=2.94)，G是保護(hù)因素(Z=-2.

25、94);rs1203527793與早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病無關(guān)聯(lián)(P=0.171);rs15677380與早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病有關(guān)聯(lián)(P＜0.001)，其中等位基因A為保護(hù)因素（Z=-8.80），G為危險(xiǎn)因素(Z=8.80)。IL-12B基因SNP2位點(diǎn)的單體型相對風(fēng)險(xiǎn)率分析，rs15677380-rs1203527793的單體型中AG，GG，GA，AA與早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病有關(guān)聯(lián)（P均小于0.001），rs1567

26、7380-rs1405036的單體型中AG、AA、GG、GA與早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病有關(guān)聯(lián)（P均小于0.001），rs15677380-rs13726393的單體型中GG、GA、從、GG與早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病有關(guān)聯(lián)（P均小于0.001）;rs1203527793-rs1405036的單體型中GA、AG與早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病有關(guān)聯(lián)(P分別為0.002、0.025);rs12035277933-rs13726393的單

27、體型中GG、AA與早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病有關(guān)聯(lián)(P分別為0.006、0.009);rs1405036-rs13726393的單體型中GA、GG與早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病有關(guān)聯(lián)(P均小于0.001)。其余各單體型與早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病無關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。IL-12B基因SNP3個(gè)SNP位點(diǎn)的單體型中rs15677380-rs1203527793-rs14050306的所有單體型都與早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病有關(guān)聯(lián)(

28、P均小于0.05);rs1203527793-rs14050306-rs13726393的單倍體中GGT、GAG、AGA與早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病有關(guān)聯(lián)（P均小于0.001）;rs15677380-rs1203527793-rs13726393的單倍體中AGG、AAA、GAA、GGA、GGG與早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病有關(guān)聯(lián)（P均小于0.001）;rs15677380-rs1405036-rs13726393的單倍體中GAG、AG

29、A、AGG、AAG、GAA與早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病有關(guān)聯(lián)（P均小于0.001）。其余各單體型與早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病無關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。IL-12B基因SNP4個(gè)位點(diǎn)的SNP單體型分析時(shí)可見rs15677380-rs1203527793-rs1405036-rs13726393中的單倍體GAGG、GAAA、GGAA、GGGA、AAGA、AAAG、AGGG與早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病相關(guān)聯(lián)（P均小于0.001）。其余各單

30、體型與早發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病無關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。⑺IL-12B四個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型與冠狀動(dòng)脈狹窄評分、射血分?jǐn)?shù)、C-反應(yīng)蛋白、脂聯(lián)素等各項(xiàng)臨床檢驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除脂聯(lián)素在rs14050306位點(diǎn)上不同基因型之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.64，P=0.027)外，各位點(diǎn)上不同基因型之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：①在中國漢族人群中IL-12B基因4個(gè)SNP位點(diǎn)酶切分型與國外報(bào)道一致，但各位