曲尼司特洗脫支架的研制及其預(yù)防豬冠狀動脈新生內(nèi)膜增殖的作用.pdf

1、第一部分：曲尼司特對VSMC和EC生長及分子機制的影響目的：觀察曲尼司特對血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)和內(nèi)皮細(xì)胞(EC)生長的影響及其分子機制，為曲尼司特應(yīng)用于藥物支架提供生物學(xué)基礎(chǔ)。 方法：以培養(yǎng)的豬骼動脈平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞株為模型，應(yīng)用活細(xì)胞計數(shù)進行細(xì)胞增殖和遷移檢測，計算半數(shù)抑制濃度(IC50)，以雷帕霉素作為對照。以流式細(xì)胞儀分析曲尼司特作用24小時后VSMC細(xì)胞周期的變化和細(xì)胞凋亡率(FITC標(biāo)記的Annexin-V)

2、，以western-blotting檢測細(xì)胞p21和p53蛋白的表達。 結(jié)果：10％的胎牛血清條件下，曲尼司特顯著抑制VSMC的增殖和遷移(在3.125mg/L～100mg/L范圍內(nèi)與劑量正相關(guān))，半數(shù)抑制濃度(IC50)為75.6umol/l。曲尼司特(75.6umol/l)作用VSMC24h后，G1期細(xì)胞數(shù)顯著減少(24％vs51％，P＜0.01)，細(xì)胞凋亡率36.7％。western-blotting檢測表明曲尼司特(75

3、.6umol/l)使VSMC的p21和p53蛋白顯著表達，而在對照組無表達。曲尼司特對VSMC增殖的抑制作用較雷帕霉素弱，而曲尼司特對EC增殖的抑制作用較雷帕霉素更弱。二者(IC5o)對VSMC的遷移抑制作用無顯著性差異；半數(shù)抑制濃度雷帕霉素(36.9nmol/l)較曲尼司特較(75.6umol/l)更顯著地抑制了EC遷移數(shù)目。 結(jié)論：曲尼司特濃度依賴性抑制VSMC的生長，阻滯細(xì)胞在G1期，其抑制作用主要通過細(xì)胞凋亡的方式。曲尼

4、司特抑制平滑肌細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期蛋白p21和p53的表達有關(guān)。與雷帕霉素比較，曲尼司特對VSMC增殖的抑制作用雖較雷帕霉素弱，但其對EC增殖和遷移的抑制作用更弱，有助于曲尼司特洗脫支架再內(nèi)皮化的過程。 第二部分：支架涂層聚合物材料的體外生物相容性研究目的：觀察支架涂層聚合物材料對血管EC生長和血液相容性的影響。方法：將TES涂層材料(PLGA)和RES的涂層材料(PEB和PBS)均勻噴涂在培養(yǎng)皿底層制成聚合物膜，將PIEC接種于

5、聚合物膜和316L不銹鋼片上。培養(yǎng)24小時，光鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)，以活細(xì)胞計數(shù)試劑測定細(xì)胞增殖和遷移。掃描電鏡觀察PRP在聚合物膜上作用1小時后血小板形態(tài)學(xué)的改變，測定健康人血液在聚合物膜上作用1小時后的紅細(xì)胞溶血率，凝血活酶時間(APTT)，凝血酶原時間(PT)，纖維蛋白原測定(FiB)和凝血酶時間(TT)。 結(jié)果：1.動脈內(nèi)皮細(xì)胞在涂層材料膜上生長良好，細(xì)胞形態(tài)正常。EC在涂層材料PEB膜和PLGA膜上生長24小時的

6、細(xì)胞增殖率分別為69.5％和69.3％，而316L不銹鋼片僅為10.8％；PEB較PBS和316L不銹鋼的細(xì)胞增殖和遷移數(shù)目顯著增加。2.吸附在外涂層聚合物表面的血小板保持了良好的自然形態(tài)，沒有出現(xiàn)偽足或團聚等被激活的現(xiàn)象。3.涂層材料對紅細(xì)胞溶血率均小于5％，表明上述材料對紅細(xì)胞相容性均良好。4.APTT在外涂層材料PEB膜較內(nèi)涂層材料PBS膜和316不銹鋼片均顯著延長(P＜0.01)，這表明外涂層材料具有良好的抗凝血作用。

7、結(jié)論：PEB和PLGA對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有較好的相容性。相對于316L不銹鋼片和單純的內(nèi)涂層材料，涂層材料PEB具有優(yōu)良的抗血小板黏附能力和抗凝血作用。提示了涂層材料PLGA和PEB具有優(yōu)良的生物相容性。 第三部分：曲尼司特涂層支架的制備及體外釋放度研究 目的：探索曲尼司特涂層支架的制備方法，考察藥物涂層在體外的釋放行為和物理化學(xué)性能，為曲尼司特涂層支架的進一步動物試驗和臨床研究提供基礎(chǔ)。 方法：1.將制備的曲尼司

8、特涂層支架，以37℃磷酸緩沖液(pH7.4)為釋放介質(zhì)，在恒溫臺式水浴振蕩器中，進行曲尼司特涂層支架(片)體外釋放度測定。2.考察PLGA中LA/GA比例、控釋層厚度、含藥率等因素對藥物體外釋放行為的影響。3.考察涂層在FTIR和X-ray方面行為、丙烯酸樹脂對涂層液接觸角以及涂層結(jié)合力方面的影響。 結(jié)果：1.曲尼司特涂層支架中曲尼司特的釋放速度隨控釋層厚度增加而減慢，隨PLGA中GA比例的增加以及含藥層中曲尼司特的含量增加而加

9、速，曲尼司特在涂層中以擴散方式釋放。2.曲尼司特未與PLGA發(fā)生化學(xué)作用，在涂層中兩者為物理混合；曲尼司特在含藥層中主要是以晶體的形式分散，無定型形式曲尼司特少；丙烯酸樹脂預(yù)涂層可以增加藥物涂層液在不銹鋼表面的潤濕程度和鋪展性，可以增加藥物涂層液在不銹鋼表面的剝離力以及結(jié)合強度；掃描電鏡發(fā)現(xiàn)支架表面藥物涂層光滑/半整，支架擴張后未發(fā)現(xiàn)支架涂層有翹起、開裂和剝脫現(xiàn)象。 結(jié)論：制備的曲尼司特涂層支架具有較理想的物理化學(xué)性能，在體外藥

10、物主要是以擴散的方式進行，且涂層的體外釋放行為可以通過控釋層厚度、聚合物類型以及含藥層藥物含量等因素的調(diào)節(jié)加以控制。 第四部分：曲尼司特洗脫支架對豬冠狀動脈新生內(nèi)膜增殖的影響 目的：評價TES和RES在小型豬冠狀動脈模型的有效性和生物相容性。 方法：制備曲尼司特洗脫支架，涂層包埋曲尼司特藥物劑量為300μg或600μg。將15只微型豬隨機分為5組：裸支架組(n=3,6枚支架)，聚合物涂層支架組(n=3,6枚支架)

11、，曲尼司特洗脫支架組[低劑量(300μg)組：n=3；600μg劑量(600μg)組：n=3各6枚支架]和雷帕霉素洗脫支架組(載Rap200μg，n=3，6枚支架)。在小型豬冠狀動脈分別植入過度擴張(支架血管直徑比為1.2-1.3∶1)的裸支架，聚合物涂層支架、曲尼司特涂層支架和雷帕霉素洗脫支架形成冠狀動脈損傷模型。術(shù)后第30天復(fù)查冠狀動脈造影術(shù)，并比較五組支架：支架血管段的損傷積分、支架內(nèi)皮化、支架內(nèi)面積、管腔面積、內(nèi)膜面積和內(nèi)膜平均

12、厚度(同時觀察支架邊緣段5mm以內(nèi)組織)。 結(jié)果：1、五組冠狀動脈大小和血管損傷積分程度無顯著差異。2、術(shù)后30天300μg劑量組和600μg劑量組的內(nèi)膜面積及內(nèi)膜平均厚度均顯著小于裸支架組和聚合物涂層支架，600ug劑量組顯著小于300μg劑量組，而600μg劑量組和雷帕霉素組無顯著差異。曲尼司特洗脫支架300ug劑量組和600μg劑量組的新生內(nèi)膜面積分別較裸支架減少了41％和53％，新生內(nèi)膜平均厚度分別減少了56％和65％。