人孤雌胚胎干細胞X染色體失活狀態(tài)的研究.pdf

1、胚胎干細胞(ES，Embryonic Stem cells)來自囊胚內(nèi)細胞團(ICM，Inner CellMass)，以自我更新和多向分化潛能的特性在干細胞研究和應用相關(guān)領(lǐng)域備受重視，人胚胎干細胞不僅為臨床上細胞移植、組織工程的應用開辟了廣闊前景，也是研究人類早期胚胎發(fā)生、細胞組織分化、基因表達調(diào)控等發(fā)育生物學事件的理想模型之一。但其應用的安全性尚存在眾多爭議。近年來研究表明：表觀遺傳學的改變多發(fā)生在胚胎早期，并且在發(fā)育和細胞增殖過程中

2、能穩(wěn)定傳遞，因此有越來越多的研究建議將表觀遺傳學各個方面的穩(wěn)定性納入胚胎干細胞的鑒定內(nèi)容之中。
　　 X染色體失活(XCI，X Chromosome Inactivation)是指哺乳動物雌性胚胎中一對X染色體中的某一條在轉(zhuǎn)錄水平上的沉默，位于X染色體上的多達1000個基因沉默使雄性和雌性性別連鎖基因的表達量平衡，是哺乳動物雌性個體維持劑量補償效應的機制，也是表觀遺傳學研究重要組成部分。XCI的選擇和啟動發(fā)生在囊胚期，由X失活中

3、心(XIC，X-Inactivation Center)控制。XIC中XIST基因(X Inactivation Specific Transcript)的缺失將導致XCI失敗。XCI的過程為：XIST基因編碼XIST-RNA，包裹在合成它的X染色體上，隨后不斷積累和擴展，招募一些對基因沉默有意義的因子如PCG蛋白從而誘導DNA甲基化和組蛋白修飾的發(fā)生，這對于XCI的建立和維持有重要作用。而保留活性的X染色體表達TSIX RNA(XIS

4、T Antisense RNA)，抑制XIST的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 XCI狀態(tài)在不同的女性人胚胎干細胞系中存在差異。Dhara和Benvenisty報道，在未分化的女性人胚胎干細胞中，兩條X染色體都是有活性的，但是Hall等人的研究發(fā)現(xiàn)在未分化的人胚胎干細胞中，也存在著XCI的現(xiàn)象，研究結(jié)果的不同可能足由不同系和同系的亞代之間差異產(chǎn)生的，而胚胎干細胞系之間不同的表觀遺傳狀態(tài)也反映了其來源的胚胎質(zhì)量、胚胎年齡以及內(nèi)細胞團分離技術(shù)和長

5、期傳代培養(yǎng)的環(huán)境之間的差異?，F(xiàn)已建立的多株人胚胎干細胞系雖然都證實其特異性標志物的表達，但其XCI狀態(tài)的不同可能會對這些細胞系的表觀遺傳特征產(chǎn)生影響，特別是可能導致發(fā)育早期的一些調(diào)控過程的改變。
　　 孤雌激活人卵母細胞是利用電化學方法，通過提高胞漿內(nèi)鈣離子濃度、抑制第二極體排出保證胚胎染色體為二倍體，在其發(fā)育成囊胚后通過分離ICM建立核型為(46，XX)的孤雌人胚胎干細胞系。雖然其核型與正常女性相同，但其兩條X染色體都是母源性

6、的，是否也存在XCI現(xiàn)象?其XCI的狀態(tài)與正常的女性人胚胎干細胞足否相同?目前尚缺乏研究回答以上問題。
　　 本研究利用我中心實驗室建立的兩株人卵母細胞孤雌激活形成的胚胎干細胞系作為研究對象，探求未分化的人孤雌胚胎干細胞(hPESCs，humanParthenogenetic Embryonic Stem Cells)的X染色體失活狀態(tài)，觀察一系列XCI標記物在其早、中、晚代培養(yǎng)過程中的表達情況，并與雙親來源的女性人胚胎干細胞(

7、hESCs，human Embryonic Stem Cells)進行比較，同時也初步研究了人孤雌胚胎干細胞與雙親來源的女性人胚胎干細胞在X-連鎖基因單核苷酸多態(tài)性(SNP，Single Nucleotide Polymorphism)位點的表達狀況。
　　 第一部分、人孤雌胚胎干細胞X染色體失活標記物表達的分析
　　 目的：
　　 研究未分化的人孤雌胚胎干細胞X染色體失活(XCI)狀態(tài)，觀察一系列XCI標記物在

8、其早、中、晚代培養(yǎng)過程中的表達情況，并與雙親來源的女性人胚胎干細胞進行比較。
　　 材料：
　　 選擇女性子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞(ESCs，Endometrial Stromal Cells)作為XCI的陽性對照模型，男性包皮成纖維細胞(HFFs，Human Foreskin Fibroblasts)作為XCI的陰性對照模型，實驗組中共有三株已經(jīng)過鑒定的人胚胎干細胞，其中兩例為卵母細胞孤雌激活形成的入胚胎干細胞hPESCs-1

9、和hPESCs-2，另一例為IVF雙親來源的女性人胚胎干細胞hESCs。
　　 方法：
　　 在這五個細胞系中，分別進行了染色體核型、XIST-DNA和X-著絲粒的熒光原位雜交、XIST和TSIX實時熒光定量PCR、XIST-RNA熒光原位雜交、組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(H3K27me3，Histone H3 Lysine27 Trimethylation)免疫熒光及Barr小體染色等檢測，并將三株人胚胎干細胞早

10、、中、晚代次的XIST和TSIX基因的表達情況、H3K27me3狀況和Barr小體陽性率分別同陽性模型ESCs進行了比較。
　　 結(jié)果：
　　 1.陽性對照模型ESCs的XCI標記物明顯：包括兩條X染色體著絲粒附近存在X染色體失活中心上的XIST基因、細胞中表達XIST基因、XIST-RNA和H3K27me3在細胞中呈一團狀聚集、Barr小體陽性率為20.33％等，而陰性對照模型HFFs中缺乏XCI標記物。
　　

11、 2.兩株人孤雌胚胎干細胞在體外長期培養(yǎng)過程中維持正常核型，兩條X染色體上都存在XIST基因，且在早、中、晚代次中保持一致。
　　 3.兩株人孤雌胚胎干細胞與雙親來源的女性人胚胎干細胞hESCs中的XCI標記物狀態(tài)相似，表現(xiàn)為：XIST基因均為低水平表達；XIST-RNA熒光原位雜交結(jié)果與之相符，在克隆團細胞中未發(fā)現(xiàn)明顯的XIST-RNA團狀聚集；細胞中H3K27me3呈散在分布，未形成積聚狀態(tài)；早、中、晚各代次的三株人胚胎干細

12、胞Barr小體陽性率明顯低于陽性對照組ESCs，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　 4.隨著體外培養(yǎng)代次的增加，實驗組三株人胚胎細胞的XIST表達量明顯上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但都顯著低于陽性對照模型(P＜0.001)；hPESCs-1在第35代、65代及95代的XIST表達量分別高于相應代次的hPESCs-2和hESCs，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 5.五個細胞系均表達TSIX

13、基因，除第95代的hPESCs-1和第35代的hPESCs-2外，其他各株細胞TSIX的表達量實驗組與對照組之間的表達量差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；實驗組三株人胚胎干細胞中TSIX的表達量隨體外培養(yǎng)代次的增加發(fā)生變化，相同細胞系在不同代次之間TSIX表達量的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；陽性對照模型ESCs中XIST與TSIX表達量的比值為14491.61，顯著高于實驗組。
　　 6.實驗組三株人胚胎干細胞隨著體外培

14、養(yǎng)代次的增加，三株人胚胎干細胞的Barr小體陽性率均升高，每株胚胎干細胞早、中、晚各代次之間Barr小體陽性率的差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；處于早、中、晚各代次時，三株人胚胎干細胞之間Barr小體陽性率的差異均沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 第二部分、人孤雌胚胎干細胞和女性人胚胎干細胞中X-連鎖基因單核苷酸多態(tài)性位點表達狀況的初步分析
　　 目的：
　　 初步研究了人孤雌胚胎干細胞X-連鎖基因SN

15、P位點表達狀況，并與雙親來源的女性人胚胎干細胞進行比較。
　　 材料：
　　 與第一部分相同
　　 方法：
　　 1.DNA測序：在GeneBank上查找X染色體連鎖的相關(guān)基因序列及其中的SNP位點，根據(jù)具體位點設計合成引物，提取細胞DNA并進行擴增、純化DNA后用測序儀測序、應用軟件分析測序結(jié)果，確定雜合的SNP位點。
　　 2.cDNA測序：針對DNA測序結(jié)果中雜合的SNP位點設計合成引物，提

16、取細胞RNA，行逆轉(zhuǎn)錄和cDNA的擴增，純化cDNA后測序，并分析測序結(jié)果。
　　 結(jié)果：
　　 1.DNA測序結(jié)果：通過對所選X連鎖基因上的14個SNP位點進行測序，陰性對照組HFFs所有測序位點均為純合，陽性對照組ESCs和實驗組三株人胚胎干細胞中存在部分雜合位點。
　　 2.在ESCs中有5個雜合位點，分別為POLA1-rs929313、CXORF22-rs4412518、CXORF22-rs7350355

17、、ATP7A-rs2227291和HS6ST2-rs5933220;在hESCs中有6個雜合位點，分別為POLA1-rs929313、GK-rs6526997、DMD-rs228406、HS6ST2-rs5933220、CXORF12-rs2266890和CXORF12-rs7350355；hPESCs-1和hPESCs-2雜合位點相同，均為CXORF22-rs4412518和CXORF22-rs7350355。
　　 3.cD

18、NA測序結(jié)果：ESCs和hESCs中部分雜合位點呈等位基因雙表達。
　　 結(jié)論：
　　 1.在未分化的兩株人孤雌胚胎干細胞中，絕大多數(shù)細胞未發(fā)生X染色體失活，而同實驗室建系的一株雙親來源的女性人胚胎干細胞也具備兩條有活性的X染色體，且在X-連鎖基因的雜合位點呈雙等位基因表達。
　　 2.隨著體外培養(yǎng)時間的增加，X染色體失活標記物在人孤雌胚胎干細胞中的表達有所上升，但遠未能達到正常女性體細胞中X染色體失活狀態(tài)的水平