人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)研究.pdf

1、一、人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)研究骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell，MSCs)是一種成體干細(xì)胞。它是存在于骨髓中的一類非造血干細(xì)胞，具有多向分化潛能，可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等多種間質(zhì)組織的細(xì)胞。人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)具有來源廣泛、分離方便、擴(kuò)增迅速、具有多向分化潛能、適合自體移植等特點(diǎn)。它可為骨、軟骨、肌肉等組織的修復(fù)提供細(xì)胞來源，是一種合適的種子細(xì)胞。

2、 隨著基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程學(xué)和組織工程學(xué)的發(fā)展，利用hMSCs的多向分化性及其可在體外表達(dá)多種外源目的基因的特性，將其作為種子細(xì)胞用于細(xì)胞治療和基因治療的研究已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。而攜帶有標(biāo)記基因的hMSCs其標(biāo)記基因可以在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中作為hMSCs的示蹤劑，對hMSCs進(jìn)行跟蹤；體外實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)記基因便于hMSCs的觀察，特別是與在與其他細(xì)胞共培養(yǎng)的體系中，可以清楚的觀察hMSCs的變化。 因此如何能將外源基因高效地轉(zhuǎn)入hM

3、SCs并能在不影響hMSCs生物學(xué)特性的情況下持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)已成為hMSCs臨床試驗(yàn)前研究的一個(gè)非常重要的熱點(diǎn)問題。目前存在的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法有很多種，不同細(xì)胞所用的轉(zhuǎn)染方法不同。而對于hMSCs來說而較為理想的轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有高效性、安全性、穩(wěn)定性，這樣才能符合臨床的使用要求。本研究比較了幾種不同類型的轉(zhuǎn)染方法，旨在于發(fā)現(xiàn)一種較適于hMSCs轉(zhuǎn)染的方法。本實(shí)驗(yàn)包括以下三個(gè)部分： 1、分離培養(yǎng)hMSCs，并對其多向分化性進(jìn)行鑒定。

4、 2、用不同的轉(zhuǎn)染方法將綠色熒光蛋白(GFP)基因轉(zhuǎn)染入hMSCs，比較不同轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染率高低。 3、用具有最高轉(zhuǎn)染率的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染hMSCs后，進(jìn)行傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，檢測標(biāo)記基因是否持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，并對hMSCs進(jìn)行多向分化性鑒定。 二、人胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)研究1981年，首次從小鼠胚囊中分離胚胎干細(xì)胞，后發(fā)現(xiàn)其具有自我復(fù)制和分化成多種組織細(xì)胞的能力。胚胎干細(xì)胞是從哺乳動(dòng)物早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(innercellma

5、ss，ICM)或桑椹胚分離出來的、能在體外長期培養(yǎng)的、高度未分化的全能(totipotent)細(xì)胞系，可在適合的條件下分化為胚胎或成體的各種類型的組織細(xì)胞。 1998年，美國威斯康星大學(xué)湯姆森教授等成功建立人胚胎干細(xì)胞系，再次把干細(xì)胞研究推到生命科學(xué)前沿。 人胚胎干細(xì)胞具有高度自我更新能力及多向性分化的潛能，有很好的研究、應(yīng)用前景。人胚胎干細(xì)胞可以用于胚胎發(fā)育的研究；可以整合外源基因研究基因功能；可以用于一些疾病的基因治

6、療；另外在人體組織細(xì)胞分化研究方面也有很重要的意義。正是因?yàn)槿绱?，hES是否能夠以及如何能夠轉(zhuǎn)入外源基因顯得尤其重要。但hES建系較難且培養(yǎng)條件比較苛刻，很難轉(zhuǎn)染外源基因得到較純的克隆。 本研究分別利用脂質(zhì)體2000和通過慢病毒載體將綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)入人胚胎干細(xì)胞，試圖得到表達(dá)GFP的hES克隆，并通過將挑選綠色熒光細(xì)胞并不斷擴(kuò)增，逐漸得到表達(dá)綠色熒光較為均一的人胚胎干細(xì)胞克隆(GFP-hES)；并對所得細(xì)胞的表面標(biāo)記、分化潛能及

7、核型進(jìn)行檢測。該部分研究分為以下三部分： 1.人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng) 2.脂質(zhì)體2000和慢病毒載體轉(zhuǎn)染hES 3.GFP-hES生物學(xué)特性的分析 第一部分人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)研究1.1目的選取幾種常用的轉(zhuǎn)染方法將GFP基因轉(zhuǎn)入人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，各自的轉(zhuǎn)染率進(jìn)行比較，以得到一種高效、可行的轉(zhuǎn)染方法，而這種方法轉(zhuǎn)染后可以得到穩(wěn)定表達(dá)目的基因的hMSCs，且同時(shí)保持hMSCs的生物學(xué)特性。 1.2

8、方法1.2.1分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增得到hMSCs，并對其多向分化潛能進(jìn)行鑒定。 1.2.2選取幾種轉(zhuǎn)染方法將GFP基因轉(zhuǎn)入第三到第六代的hMSCs，24小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測各種轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染率。 1.2.3選取幾種轉(zhuǎn)染方法中具有最高轉(zhuǎn)染率的方法轉(zhuǎn)染GFPhMSCs，連續(xù)培養(yǎng)，熒光顯微鏡檢測GFP是否穩(wěn)定表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測陽性細(xì)胞的百分比；轉(zhuǎn)入GFP的hMSCs進(jìn)行成骨成脂鑒定，檢測是否仍具有多向分化潛能。 1.3

9、結(jié)果1.3.1hMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定Ficoll-Hypaque分離液得到的單個(gè)核細(xì)胞24小時(shí)后有貼壁細(xì)胞，3天后可見梭形細(xì)胞。原代培養(yǎng)約12-15天可達(dá)80-90％融合。胰酶消化傳代后，24小時(shí)內(nèi)完全貼壁，3-4天內(nèi)達(dá)到80-90％融合。 成脂誘導(dǎo)2周后，進(jìn)行油紅O染色，可見呈橙紅色的脂滴。成骨誘導(dǎo)3周后，用茜素紅進(jìn)行染色，可見呈桔紅色的鈣結(jié)節(jié)。 1.3.2hMSCs轉(zhuǎn)染方法的比較與篩選轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢

10、測各種方法的轉(zhuǎn)染率。其中Effectene轉(zhuǎn)染試劑盒的效率為3.97％，Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑盒的轉(zhuǎn)染率為3.03％，核轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染率為19.02％，電穿孔的轉(zhuǎn)染率為1.8％，慢病毒的轉(zhuǎn)染率為81.4％。因此，在幾種方法中，慢病毒轉(zhuǎn)染具有最高的轉(zhuǎn)染率。 1.3.3慢病毒轉(zhuǎn)染hMSCs外源基因表達(dá)基因和多向分化潛能將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞連續(xù)傳代，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光并未消減，流式細(xì)胞儀檢測GFP陽性細(xì)胞達(dá)85.4％。油紅O染色

11、轉(zhuǎn)染后定向向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)的hMSCs發(fā)現(xiàn)橙紅色的脂滴；用茜素紅染色轉(zhuǎn)染后定向向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的hMSCs發(fā)現(xiàn)桔紅色的鈣結(jié)節(jié)。 1.4結(jié)論1.4.1成功分離培養(yǎng)和擴(kuò)增了hMSCs，且得到的hMSCs具有多向分化潛能。 1.4.2通過幾種不同轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染率的比較，發(fā)現(xiàn)慢病毒轉(zhuǎn)染效率最高，且未見細(xì)胞損傷，可用于hMSCs的轉(zhuǎn)染。 1.4.3慢病毒轉(zhuǎn)染后的攜帶有GFP基因的hMSCs可以長期持續(xù)表達(dá)其攜帶基因，并同時(shí)具有多

12、向分化潛能。 第二部分人胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)研究2.1目的本部分研究比較了脂質(zhì)體2000和慢病毒載體轉(zhuǎn)染hES，目的是找尋一種適用于hES的轉(zhuǎn)染方法，并可以得到保持hES生物學(xué)特性的表達(dá)GFP的hES克隆(GFP-hES)。 2.2方法2.2.1hES的培養(yǎng)：每天進(jìn)行換液，每6-10天傳代一次。 2.2.2分別用脂質(zhì)體2000和慢病毒載體轉(zhuǎn)染GFP進(jìn)入hES，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況。 2.2.3GFP-

13、hES生物學(xué)特性的分析：對GFP-hES的分子標(biāo)記、核型及分化能力進(jìn)行檢測。 2.3結(jié)果2.3.1在本實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)條件下，hES有較強(qiáng)的增殖力且可以保持未分化狀態(tài)。 2.3.2轉(zhuǎn)染后，熒光顯微鏡下觀察，脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染效率非常低，且細(xì)胞增殖緩慢；慢病毒的轉(zhuǎn)染效率高一些，細(xì)胞增殖力旺盛。 2.3.3GFP-hES的生物學(xué)特性 GFP-hES表達(dá)OCT-4、GCTM-2、SSEA-3、SSEA-4和TRA-