人類孤雌胚胎干細(xì)胞的表遺傳狀態(tài)-基因組印記初步研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells,ESC)來源于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán),ESC可分化為3個(gè)胚層的各種細(xì)胞并具有體外無限增殖的能力。人類胚胎干細(xì)胞(humanembryonic stem cells,hESC)的建系使ESC用于治療人類組織器官退化性疾病成為可能。將hESC分化為各種成體細(xì)胞,有望未來應(yīng)用于人類退變性疾病如帕金森氏病、阿爾茲默病、以及糖尿病等疾病的治療。然而,來源于受精囊胚的人類雙親胚胎干細(xì)胞(human bip

2、arental embryonic stem cells,hBESC)不僅與需要行細(xì)胞組織移植的患者存在遺傳學(xué)上的差異,而且目前仍然存在較大的倫理學(xué)爭(zhēng)議。2007年我中心建立了非受精囊胚來源的hESC系,即人類孤雌胚胎干細(xì)胞(human parthenogenetic embryonic stem cells,hPESC)。在電激活和化學(xué)激活作用下,人類MII卵子卵漿內(nèi)Ca2+振蕩,使其完成第二次減數(shù)分裂,并進(jìn)一步發(fā)育形成胚胎,即為孤雌

3、激活。來源于人類孤雌囊胚的hPESC,與卵子提供者之間主要組織相容復(fù)合物(Majior histocompatibility complex,MHC)匹配,避免了移植后免疫排斥反應(yīng)及破壞受精胚胎所引起的倫理學(xué)爭(zhēng)議。
　　 但是由于缺乏父源性遺傳物質(zhì),hPESC的臨床應(yīng)用安全性值得我們進(jìn)一步深入探討。既往的哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明:孤雌胚胎由于基因印記異常狀態(tài)導(dǎo)致其無法發(fā)育至成體。在人中已發(fā)現(xiàn)的印記基因約有60余個(gè)。這些基因己顯示在胚胎生

4、長(zhǎng)、特定細(xì)胞系分化中起重要調(diào)控作用。印記基因等位特異性表達(dá)通常與DNA甲基化有關(guān)。大多數(shù)的DNA甲基化發(fā)生于差異甲基化區(qū)(Differentially methylatedregions,DMRs)。DMRs中親緣特異性甲基化使母源及父源等位基因得以區(qū)分,并調(diào)節(jié)印記基因的轉(zhuǎn)錄。由于孤雌胚胎中兩套基因組均為母源性的,理論上母本基因?qū)殡p倍表達(dá),父本基因缺失。人類印記基因破壞或不適當(dāng)表達(dá)與某些臨床綜合征及腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。因此基因組印記可能

5、會(huì)成為hPESC用于臨床治療上的障礙。盡管鼠,兔,牛,非人靈長(zhǎng)類,及人激活胚胎干細(xì)胞相繼建立,關(guān)于孤雌胚胎干細(xì)胞(Parthenogenetic embryonic stem cells,PESC)中印記狀態(tài)的認(rèn)識(shí)仍然非常有限。至今沒有關(guān)于hPESC中印記基因表達(dá)狀態(tài)的研究。因此,評(píng)估hPESC中印記狀態(tài),以及印記基因在hPESC細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)及分化過程中的變化,評(píng)估hPESC表遺傳的安全性具有重要意義。
　　 本研究選擇了目

6、前所有有明確印記狀態(tài)的人類印記基因,在2株hPESC細(xì)胞系中用高通量PCR芯片的方法測(cè)定其mRNA水平,并和hBESC比較,從整體水平全面評(píng)估hPESC的印記狀態(tài)；并分析印記基因表達(dá)在長(zhǎng)期傳代中的穩(wěn)定性；分析印記基因在hPESC早期分化一胚體(Embryoid body,EB)形成中表達(dá)水平的變化；用DNA甲基化測(cè)序的方法,探索印記基因表達(dá)其后的機(jī)制。
　　 第一部分未分化人類孤雌胚胎干細(xì)胞與人類雙親胚胎干細(xì)胞的印記基因表達(dá)狀態(tài)

7、比較
　　 研究目的：
　　 1.分析未分化hPES中印記基因表達(dá)狀態(tài)并與未分化hBES比較。
　　 2.探討未分化hPES體外長(zhǎng)期培養(yǎng)對(duì)印記基因表達(dá)水平的影響。
　　 材料與方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):本文選擇了所有目前在人類中有明確印記狀態(tài)(母源或父源表達(dá))的基因,參見http://WWW.geneimprint.com；http://WWW.otago.ac.nz,共65個(gè)印記基因,其中父源

8、表達(dá)(父本)基因27個(gè),母源表達(dá)(母本)基因38個(gè)。實(shí)驗(yàn)材料:2株hPES1、hPES2,1株人類雙親胚胎干細(xì)胞(human biparentalembryomc stem cells,hBES)系:hBES。其中hBES設(shè)為對(duì)照組,hPES1、hPES2設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。每組取早代、中代、晚代細(xì)胞,分別檢測(cè)印記基因mRNA的表達(dá)。
　　 2.3株人類胚胎干細(xì)胞系均培養(yǎng)于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mouse embryofibroblast

9、s,MEFs)飼養(yǎng)層上,按標(biāo)準(zhǔn)的人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。各取不同的6個(gè)代次:早代(p27,p37)、中代(p47,p57)、晚代(p67,p77),每隔10代各取一次細(xì)胞,提取總RNA。
　　 3.對(duì)提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用PCR array的方法,進(jìn)行SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR。
　　 4.比較3組間印記基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的差異。
　　 5.分析每組中傳代次數(shù)與印記基因mRNA

10、表達(dá)水平之間的相關(guān)關(guān)系。
　　 6.比較每組中50代前后細(xì)胞的印記基因mRNA表達(dá)水平差異。
　　 7.比較在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)中3組間印記基因發(fā)生變化的異同點(diǎn)。
　　 8.分析染色體核型與印記基因表達(dá)異常的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.與對(duì)照組hBES比較,hPES1中母本基因ATP10A升高了2.7倍(P<0.05),ZNF264升高了6.5倍(P<0.001)；hPES2中ATP10A升高了2.

11、9倍(P<0.05)；ZNF264升高了4.2倍(P<0.05)。
　　 2.兩株hPES細(xì)胞與hBES細(xì)胞比較,除ATP10A、ZNF264外其它25個(gè)母本基因轉(zhuǎn)錄水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。
　　 3.兩株hPES系細(xì)胞間比較,所檢測(cè)的27個(gè)母本基因的表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異。
　　 4.與hBES比較,38個(gè)父本基因中15個(gè)基因:PEG10,MAGEL2,NDN,KCNQ1OT1,SNORD109A,SNRPN

12、,SNURF,SNORD107,SNORD64,SNORD108,SNORD109B,ZIM2,PEG3,IPW和PSIMCT-1轉(zhuǎn)錄水平在hPES1和hPES2中均表現(xiàn)為明顯下降或失活。
　　 5.與hBES比較,hPES1中SGCE的表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異,hPES2中SGCE轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)1.8倍(P<0.05)。
　　 6.與hBES比較,其它23個(gè)父本基因在兩株hPES中的轉(zhuǎn)錄水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異。
　

13、　 7.兩株hPES細(xì)胞之間檢測(cè)的38個(gè)父本基因表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異。
　　 8.在未分化hBES中,父源表達(dá)的INPP5F、KCNQ1OT1和NNAT,其轉(zhuǎn)錄水平與hBES傳代次數(shù)顯著相關(guān)；其余62個(gè)印記基因表達(dá)水平與hBES傳代次數(shù)無相關(guān)關(guān)系。
　　 9.比較50代前后的hBES細(xì)胞中印記基因表達(dá)水平,CALCR、PEG10、INPP5F、KCNQ1OT1的表達(dá)水平在50代后明顯下降,P<0.05；而NNAT在

14、50代后的hBES中表達(dá)水平明顯升高,P<0.01。其余60個(gè)印記基因在50代前后的細(xì)胞中均無明顯變化。
　　 10.hPES1中SNURF表達(dá)水平與傳代次數(shù)正相關(guān)(r2=.8497,P<0.05)；CDKN1C在hPES2中與傳代次數(shù)呈正相關(guān)(r2=.8796,P<0.05)。hPES1中除SNURF外其余64個(gè)印記基因、hPES2中除CDKN1C外其余64個(gè)印記基因表達(dá)水平與傳代次數(shù)無相關(guān)關(guān)系。
　　 11.6個(gè)基因

15、(TCEB3C,PRIM2,MESTIT1,PEG10,SNRPN,SANG)在50代后的hPES1細(xì)胞中出現(xiàn)明顯上升,其余59個(gè)印記基因在50代前后的hPES2細(xì)胞中均無明顯變化；而在hPES2中,僅僅CDKN1C在50代后的細(xì)胞中出現(xiàn)變化,上調(diào)2.0倍(P<0.05),其余64個(gè)印記基因在50代前后的hPES2細(xì)胞中均無明顯變化。
　　 12.hPES1和hPES2在體外培養(yǎng)70代以后,核型出現(xiàn)了變化,包括X染色體丟失,及平

16、衡異位。
　　 結(jié)論：
　　 1.hPES細(xì)胞中絕大部分(93.0％)母本基因、超半數(shù)(hPES1:58.3％；hPES2:55.6％)父本基因正常表達(dá),說明hPES細(xì)胞比預(yù)想(母本基因雙倍表達(dá),父本基因缺失)有更多的印記安全性。
　　 2.hPES與hBES間的主要差異是hPES1中15個(gè)、hPES2中16個(gè)父本基因的下調(diào)或失活。這些父本基因的異常表達(dá)可能是hPES細(xì)胞的主要印記缺陷。
　　 3.無論h

17、PES還是hBES,在體外培養(yǎng)過程中,絕大部分印記基因的表達(dá)維持穩(wěn)定。
　　 4.hPES1與hPES2的印記狀態(tài)并不完全一致,可能與體外長(zhǎng)期培養(yǎng)有關(guān)。
　　 5.hPES中印記基因的異常表達(dá)與染色體核型無關(guān)。
　　 第二部分早期體外分化人類孤雌胚胎干細(xì)胞與人類受精胚胎干細(xì)胞的印記基因表達(dá)狀態(tài)比較
　　 研究目的：
　　 1.探討印記基因在hBES早期分化階段的表達(dá)變化。
　　 2.探討印

18、記基因在hPES早期分化階段的表達(dá)變化,明確在未分化hPES中探及的差異表達(dá)印記基因,在hPES細(xì)胞向胚體方向分化時(shí)有無修正。
　　 3.分析hPES與hBES在體外早期分化階段印記基因變化的差異。
　　 材料與方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):選擇所有目前在人類中有明確印記狀態(tài)(母源或父源表達(dá))的基因,參見http://WWW.geneimprint.com；http://WWW.otago.ac.nz,共65個(gè)印記

19、基因,其中父源表達(dá)(父本)基因27個(gè),母源表達(dá)(母本)基因38個(gè)。實(shí)驗(yàn)材料:實(shí)驗(yàn)組1:hPES1分化第14天的胚體,對(duì)照組1:hPES1未分化細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組2:hPES2分化第14天胚體,對(duì)照組2:hPES2未分化細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組3:hBES分化第14天胚體,對(duì)照組3:未分化hBES。
　　 2.3株人類胚胎干細(xì)胞系均培養(yǎng)于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mouse embryofibroblasts,MEFs)飼養(yǎng)層上,按標(biāo)準(zhǔn)的人類胚胎干細(xì)胞培

20、養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng),在細(xì)胞傳代至p27、p37、p47代時(shí),將細(xì)胞分為兩份,一份用于收集并提取總RNA,另一份hES細(xì)胞用膠原酶孵育,分離,懸浮培養(yǎng)于干細(xì)胞分化培養(yǎng)液中形成胚體達(dá)14天,取分化第14天的胚體,提取總RNA。
　　 3.對(duì)提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用PCR array的方法,進(jìn)行SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR。
　　 4.測(cè)定hBES體外分化第14天胚體中印記基因表達(dá)狀態(tài)并與分化前比較。
　　

21、 5.分別測(cè)定2株hPES體外分化第14天胚體中印記基因表達(dá)水平,并與分化前比較。
　　 6.在每個(gè)研究組中用Ontology analysis的方法對(duì)分化前后差異表達(dá)的基因進(jìn)行基因功能分析。
　　 7.比較hPES1、hPES2、hBES細(xì)胞分化前后基因變化的異同點(diǎn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.與未分化hBES比較,在hBES體外分化14天的胚體中,有5個(gè)母源表達(dá)(SL,C22A2,SLC22A3,CO

22、PG2IT1,H19和CPA4),和1個(gè)父源表達(dá)的印記基因IGF2明顯上調(diào)。其余印記基因在hBES的EB形成過程中未發(fā)生明顯變化。
　　 2.在hPES1來源的胚體中,6個(gè)基因(SLC22A2,SLC22A18,CPA4,H19和WT1)表達(dá)水平明顯升高而1個(gè)基因:DLGAP2表達(dá)水平明顯下降。其余58個(gè)印記基因在hPES1的EB形成過程中未發(fā)生明顯變化。
　　 3.在hPES2來源的胚體中,7個(gè)印記基因(SLC22A2

23、,CPA4,H19,SLC22A18,OSBPL5,GNAS and IGF2)上調(diào),而2個(gè)印記基因(DLGAP2和INPP5F)下調(diào)。其余56個(gè)印記基因在hPES2的EB形成過程中未發(fā)生明顯變化。
　　 4.在hBES來源EB中,與未分化hBES細(xì)胞比較,差異表達(dá)印記基因的基因功能分析顯示:這些基因富于離子連接、離子轉(zhuǎn)運(yùn)及染色質(zhì)重塑功能。
　　 5.在hPES來源EB形成中,與未分化hPES比較,差異表達(dá)印記基因的基因

24、功能分析顯示:這些基因富于離子連接、離子轉(zhuǎn)運(yùn)及生物調(diào)節(jié)功能。
　　 6.SLC22A2,SLC22A18(or SLC22A3),CPA4,H19和IGF2無論在hBES還是在hPES細(xì)胞的早期分化中均出現(xiàn)明顯上調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1.印記基因H19,IGF2,SLC22A2,SLC22A3/SLC22A18和CPA4的表達(dá)與人類胚胎干細(xì)胞早期分化發(fā)育調(diào)節(jié)有關(guān)。
　　 2.在早期分化階段,hBES與

25、hPES的印記基因表達(dá)水平變化非常類似。
　　 3.在未分化hPES中高表達(dá)的母本基因與低表達(dá)的父本基因在hPES分化為胚體后沒有發(fā)生明顯變化。
　　 第三部分人類孤雌胚胎干細(xì)胞和人類雙親胚胎干細(xì)胞的印記基因DNA甲基化狀態(tài)比較
　　 研究目的：
　　 1.探討hBES中4個(gè)印記基因差異甲基化區(qū):(SNRPN-SNURF、ZIM2/PEG3、SGCE/PEG10 DMR及KVDMR1)甲基化狀態(tài)及其在體外

26、長(zhǎng)期培養(yǎng)傳代后的變化。
　　 2.分析hPES中4個(gè)印記基因差異甲基化區(qū)甲基化狀態(tài)及其在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)傳代后的變化。
　　 3.比較hPES與hBES中4個(gè)印記基因的差異甲基化區(qū)甲基化狀態(tài)的差異。
　　 4.探討印記基因的差異甲基化區(qū)甲基化水平在hBES早期分化階段的變化。
　　 5.分析印記基因的差異甲基化區(qū)甲基化水平在hPES早期分化階段的變化。
　　 6.探討hPES及受精胚胎干細(xì)胞中印記基因

27、表達(dá)水平與差異甲基化區(qū)甲基化水平之間的關(guān)系。
　　 材料與方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):根據(jù)第一、第二部分的結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)hPES1和hPES2中分別有15/16個(gè)父本基因表達(dá)水平異常。我們選擇了4個(gè)與這些父本基因相關(guān)的印記調(diào)控中心-差異甲基化區(qū):SNRPN-SNURF、ZIM2/PEG3、SGCE/PEG10 DMR及KVDMR1,測(cè)定其甲基化水平。實(shí)驗(yàn)樣本:未分化hBES,p27；未分化hBES,p77；未分化hPES

28、1,p27；未分化hPES1,p77；未分化hPES2,p27；未分化hPES2,p77;hBES來源EB；hPES1；來源EB；hPES2來源EB。
　　 2.3株人類胚胎干細(xì)胞系均培養(yǎng)于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mouse embryofibroblasts,MEFs)飼養(yǎng)層上,按標(biāo)準(zhǔn)的人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。自早代(p27)、晚代(p77),各取一次細(xì)胞,提取基因組DNA。將hES細(xì)胞用膠原酶孵育,分離,懸浮培養(yǎng)于干細(xì)胞

29、分化培養(yǎng)液中形成胚體達(dá)14天,取分化第14天的胚體,提取基因組DNA。
　　 3.對(duì)提取的基因組DNA行重硫酸鹽處理、克隆、測(cè)序,分析差異甲基化區(qū)SNRPN-SNURF、ZIM2/PEG3、SGCE/PEG10 DMR及KVDMR1的甲基化水平。
　　 4.比較3組間印記基因的差異甲基化區(qū)SNRPN-SNURF、ZIM2/PEG3、SGCE/PEG10 DMR及KVDMR1的甲基化水平的差異。
　　 5.比較每組

30、中早代及晚代未分化細(xì)胞之間差異甲基化區(qū)的甲基化水平差異。
　　 6.比較每組中分化前后細(xì)胞差異甲基化區(qū)的甲基化水平差異。
　　 7.分析差異甲基化區(qū)SNRPN-SNURF、ZIM2/PEG3、SGCE/PEG10 DMR及KVDMR1的甲基化水平與相應(yīng)基因mRNA表達(dá)水平之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.hBESC早代及晚代細(xì)胞中KVDMR1,SGCE/PEG10,PEG3/ZIM2、SNURF-SN

31、RPN DMR均顯示嚴(yán)格的半數(shù)甲基化。
　　 2.在hPES1早代及晚代細(xì)胞中,3個(gè)差異甲基化區(qū):KVDMR1,PEG3/ZIM2、SNURF-SNRPN DMR均顯示為重度甲基化狀態(tài),其甲基化水平較hBESC明顯增高。
　　 3.在hPES2早代及晚代細(xì)胞中,3個(gè)差異甲基化區(qū):KVDMR1,PEG3/ZIM2、SNURF-SNRPN DMR均顯示為重度甲基化狀態(tài),其甲基化水平較hBESC明顯增高。
　　 4.h

32、BESC分化第14天的胚體中KVDMR1,SGCE/PEG10,PEG3/ZIM2,SNURF-SNRPN DMR均顯示嚴(yán)格的半數(shù)甲基化。
　　 5.在hPES1及hPES2來源第14天的胚體中差異甲基化區(qū):KVDMR1,PEG3/ZIM2、SNURF-SNRPN DMR均顯示為重度甲基化狀態(tài)。
　　 6.hPES1早代、晚代、分化第14天胚體中SGCE DMR顯示明顯去甲基化；hPES2早代、晚代、分化第14天胚體中S

33、GCEDMR為輕度去甲基化。
　　 結(jié)論：
　　 1.hBESC中KVDMR1,SGCE/PEG10,PEG3/ZIM2,SNURF-SNRPN DMR均為正常的等位基因特異性基化狀態(tài),在hBESC體外長(zhǎng)期傳代及向胚體方向分化時(shí)正常甲基化狀態(tài)維持不變。
　　 2.2株hPESC中KVDMR1,PEG3/ZIM2,SNURF-SNRPN DMR維持了母源甲基化狀態(tài),3個(gè)DMRs的重度甲基化狀態(tài)在hPESC長(zhǎng)期傳代及

34、向胚體方向分化時(shí)維持不變。
　　 3.兩株hPESC中KVDMR1,PEG3/ZIM2、SNURF-SNRPN DMRs的重度甲基化狀態(tài)是導(dǎo)致相應(yīng)父本基因靜默或下調(diào)的可能因?yàn)椤?br>　　 4.hPESC中SGCE/PEG10的去甲基化是SGCE在hPESC中激活甚至正常表達(dá)的可能因?yàn)椤?br>　　 5.KVDMR1,SGCE/PEG10、PEG3/ZIM2、SNURF-SNRPN DMR的DNA甲基化可能是hPESC中相應(yīng)