靈芝酸的液體發(fā)酵及其分離純化的研究.pdf

1、靈芝酸是靈芝中除多糖外另一類(lèi)具有廣泛生理活性的物質(zhì)，被證明具有止痛、鎮(zhèn)靜、抑制組織胺釋放、解毒、保肝、抗腫瘤等活性。因此如何利用液態(tài)發(fā)酵大量生產(chǎn)靈芝酸對(duì)擴(kuò)大其應(yīng)用范圍具有極其重要的意義。本文以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵法大量生產(chǎn)靈芝酸為目的，就靈芝酸的測(cè)定方法、發(fā)酵工藝、分離提取、結(jié)構(gòu)鑒定開(kāi)展研究工作，主要研究結(jié)果如下： 1.研究了靈芝酸的薄層層析定性檢測(cè)方法，以甲苯：乙酸乙酯：乙酸(13:4:0.4)作為展層劑，用10％硫酸乙醇溶液顯色，出現(xiàn)R

2、f0.17，Rf0.56，Rf0.70三個(gè)斑點(diǎn)，且隨著顯色時(shí)間的增加，顏色由黃→紅→紫→褐色，表明其為三萜類(lèi)物質(zhì)。建立了紫外分光光度法測(cè)靈芝酸含量的方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線為C=(0.331×A254-0.004)×n，線性相關(guān)系數(shù)為0.9998，精密度實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和回收率實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.56％，3.6％，1.1％。表明此法準(zhǔn)確可靠，且簡(jiǎn)便、快速。 2.研究了溶解氧對(duì)靈芝酸發(fā)酵的影響。結(jié)果表明：前48h調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速175r

3、pm，48h至發(fā)酵結(jié)束調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速75rpm的培養(yǎng)方式下生物量、胞外靈芝酸及胞內(nèi)靈芝酸的產(chǎn)量較自然發(fā)酵分別提高10.8％，14.5％，23.5％，總靈芝酸平均生產(chǎn)強(qiáng)度(5.43mg/L·h)比自然發(fā)酵條件下(4.50mg/L·h)提高了20.7％；先搖床培養(yǎng)96h后靜置培養(yǎng)60h的方式下生物量、胞外靈芝酸及胞內(nèi)靈芝酸的產(chǎn)量較自然發(fā)酵分別提高4.6％、56.1％、30.7％，總靈芝酸平均生產(chǎn)強(qiáng)度(3.84mg/L·h)比自然發(fā)酵條件下(4

4、.50mg/L·h)降低了14.7％.研究了pH值對(duì)靈芝酸發(fā)酵的影響，未控制pH發(fā)酵條件下，生物量最大值達(dá)到了11.14g/L；控制恒定pH4.5的發(fā)酵條件下，有利于靈芝酸的生成，總靈芝酸產(chǎn)量最大為538.01mg/L。由此提出了兩段pH控制策略：發(fā)酵前期pH不加控制，當(dāng)pH降至4.5時(shí)，控制pH在4.5，應(yīng)用此策略生物量、胞外及胞內(nèi)靈芝酸的產(chǎn)量較自然發(fā)酵分別提高了6.8％、7.5％、3.4％. 3.利用AB-8大孔吸附樹(shù)脂提取

5、分離發(fā)酵液中靈芝酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明上樣的最佳條件為pH2，流速為2mL/min，此時(shí)AB-8樹(shù)脂對(duì)靈芝酸的吸附量達(dá)8.837mg/g。最佳洗脫方案為：水→20％乙醇→40％乙醇→95％乙醇。利用定性顯色反應(yīng)和薄板層析，鑒定了95％乙醇洗脫流分含有靈芝三萜類(lèi)成分。大孔樹(shù)脂95％乙醇洗脫組分經(jīng)反相C-18柱和制備高效液相色譜分離，經(jīng)HPLC檢測(cè)分析，純度達(dá)到92.5％.由其紅外光譜，質(zhì)譜和1H-NMR圖譜分析，確定該化合物的分子量為470，推

6、斷其為赤芝酸F甲酯，其分子式為C28H38O6，其結(jié)構(gòu)類(lèi)型為Ⅳ型。 4.利用單因子試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化了菌絲體中靈芝酸的提取工藝。結(jié)果表明在乙醇濃度為93.6％(v/v)、提取溫度79.1°C、提取液固比42.2:1、提取次數(shù)2次、每次提取時(shí)間2h的條件下，靈芝酸的提取率最高，為28.72mg/g干菌絲。將提取得到的靈芝酸，經(jīng)有機(jī)溶劑萃取、硅膠柱層析等分離純化步驟，得到組分A和組分B，薄層層析檢測(cè)，各有一個(gè)主要斑點(diǎn)，其Rf值分別為