雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑抑制前列腺癌細(xì)胞系PC3生長的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究分別探討了17 β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬通過ER激活MAPK通路對前列腺癌細(xì)胞PC3生長的影響。 研究材料與方法： 1、17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬對PC3細(xì)胞生長的抑制作用不同濃度17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬作用PC3細(xì)胞48、72、96、120h后，應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率(％)=(1一試驗(yàn)組光A<,490>/對照組光An90)×100％。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2、 2、細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測17 β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬作用PC3細(xì)胞48 h后，按照試劑盒說明應(yīng)用Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，熒光顯微鏡下觀察。 3、免疫組織化學(xué)方法檢測Bcl-2和caspase-3表達(dá)17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬作用PC3細(xì)胞48 h后，按照博士德免疫組織化學(xué)試劑盒說明染色，顯微鏡下觀察Bcl-2和caspase-3的表達(dá)強(qiáng)度。 4、ERK1/2、JNK和p38活性的測定17β雌

3、二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬作用PC3細(xì)胞不同時間后，提取蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，應(yīng)用western blot檢測PC3細(xì)胞中磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)、磷酸化的JNK(p-JNK)和磷酸化的p38(p-p38)的表達(dá)，以及ERK1/2，JNK和p38的表達(dá)，以p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK和p-p38/p38代表MAPK的激活量。分別應(yīng)用10μmol/l MEK1/2抑制劑PD98059、J

4、NK抑制劑SP600125和p38抑制劑SB203580預(yù)先和細(xì)胞孵育1h后應(yīng)用17 β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬作用30min，應(yīng)用western blot檢測ERK1/2、JNK和p38的活性，明確上述抑制劑抑制藥物對MAPK的激活作用。 5、細(xì)胞周期分布檢測收集經(jīng)不同藥物處理48h后的細(xì)胞，PI染色法用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞亞二倍體峰和細(xì)胞周期分布，應(yīng)用CellQuest 3.0軟件采集數(shù)據(jù)，應(yīng)用ModFit軟件分析，結(jié)果用百

5、分率表示。 6、ERα、ER β、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白(P21<'WAF1>)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinDl)基因表達(dá)的檢測收集經(jīng)不同藥物處理或未處理18h后的細(xì)胞，Trizol提取總RNA，應(yīng)用TaKaRa公司的RT-PCR試劑盒擴(kuò)增上述基因，PCR產(chǎn)物1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，生物圖象分析儀檢測吸收光度值進(jìn)行半定量分析。 7、TLINEL染色檢測細(xì)胞凋亡率不同藥物作用PC3細(xì)胞48h后，按照博士德TUN

6、EL試劑盒說明染色，顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，每張切片隨機(jī)選取10個高倍視野，計數(shù)100個細(xì)胞，以其中凋亡細(xì)胞占的百分比作為細(xì)胞凋亡率。 8、Bcl-2、caspase-3、Bax、p-Bcl-2的表達(dá)不同藥物作用PC3細(xì)胞特定時間后，提取蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，應(yīng)用western blot檢測PC3細(xì)胞中上述蛋白表達(dá)的變化。 9、統(tǒng)計學(xué)分析各組間比較采用單因素方差分析。 研究結(jié)果：

7、 RT-PCR在PC3細(xì)胞中檢測到ERα和ERβ表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)其表達(dá)ERα異構(gòu)體。MTT檢測發(fā)現(xiàn)17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬呈濃度依賴性抑制PC3細(xì)胞增殖。17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬抑制PC3生長的最小濃度分別為10<'-5>mol/l、 10<'-6>mol/l和10<'-7>mol/l。10<'4> mol/1 17β雌二醇、10<'5>mol/l他莫昔芬和10<'-6>mol/l雷洛昔芬分別作用48h后，Hoechst染

8、色在處理組發(fā)現(xiàn)典型凋亡改變，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈致密濃染和呈碎塊狀致密濃染的典型凋亡表現(xiàn)。免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)10<'-4>mol/17β雌二醇、10<'-5>mol/l他莫昔芬和10<'-6>mol/l雷洛昔芬分別作用48h后，PC3細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)比對照組表達(dá)減少，caspase-3的表達(dá)則比對照組表達(dá)增加。 Western blot檢測表明在10<'-4> mol/l 17β雌二醇和10<'-5>mol/l他莫

9、昔芬在PC3細(xì)胞中以時間依賴的方式瞬間激活ERK1/2、JNK和p38信號通路。而10<'-5>mol/l雷洛昔芬僅激活ERK1/2和p38信號通路，但不激活JNK通路。10μmol/l PD98059、SP600125和SB203580分別預(yù)先和細(xì)胞孵育1h則可以完全抑制上述藥物對MAPK信號通路的激活。 流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)10<'-4>mol/l 17 β雌二醇作用48h后PC3細(xì)胞周期阻滯于G<,1>期，10μmol/l P

10、D98059預(yù)處理1h后使10<'-4>mol/l 17β雌二醇作用48h的細(xì)胞進(jìn)一步阻滯在G<,1>期，10μmol/l SP600125預(yù)孵育1h后減輕10<'-4>mol/l 17β雌二醇作用48h引起的細(xì)胞周期阻滯，10gmol/l SB203580預(yù)孵育1h后則使10<'-4>mol/l 17β雌二醇作用48h的細(xì)胞進(jìn)入S期。10<'-5>mol/l他莫昔芬作用48h后PC3細(xì)胞周期阻滯于G<,1>期，10μmol/l PD9

11、8059預(yù)處理1h后使10<'-5>mol/l他莫昔芬作用48h的細(xì)胞輕度阻滯在G<,1>期，10μmaol/l SP600125預(yù)孵育1h后10<'-5>mol/l他莫昔芬作用48h細(xì)胞依然阻滯在G<,1>期，10μmol/l SB203580預(yù)孵育1h后則使10<'-5>mol/l他莫昔芬作用48h的細(xì)胞進(jìn)入S期。10<'-6>mol/l雷洛昔芬作用48h后PC3細(xì)胞周期阻滯于G<,1>期，10μmol/l PD98059預(yù)處理1h

12、后使10<'-6>mol/l雷洛昔芬作用48h的細(xì)胞輕度阻滯在G<,1>期，10μmol/l SB203580預(yù)孵育1h后則使10<'-6>mol/l雷洛昔芬作用48h的細(xì)胞周期輕度阻滯在G<,1>期。 研究結(jié)論： 17 β雌二醇通過持續(xù)激活JNK增加P21<'WAF1>基因表達(dá)，同時激活p38減少cyclinDl表達(dá)，使細(xì)胞阻滯在G<,1>期。其還通過持續(xù)激活JNK和p38通路引起PC3細(xì)胞凋亡。但17 β雌二醇同時通

13、過激活ERK1/2通路又可以輕微拮抗上述作用。他莫昔芬通過持續(xù)激活ERK1/2增加P21<'WAF1>基因表達(dá)，同時激活p38減少cyclinD1表達(dá)，進(jìn)而使細(xì)胞阻滯在G<,1>期。其還通過持續(xù)激活JNK和p38引起B(yǎng)cl-2磷酸化使Bcl-2失效降解，促進(jìn)PC3細(xì)胞凋亡。 雷洛昔芬通過持續(xù)激活ERK1/2增加P21<'WAFI>基因表達(dá)，同時激活p38減少cyclinD1表達(dá)，進(jìn)而使細(xì)胞阻滯在G<,1>期。雷洛昔芬通過激活p3