灌酒大鼠腦組織Ngb、Hif-1α表達和Na+,K+-ATPase活性變化及其與TSAH的關系研究.pdf

1、背景與目的:
　　外傷性蛛網(wǎng)膜下腔出血(traumatic subarachnoid haemorrhage,TSAH)案例中,許多是酗酒后頭頸部遭受輕微暴力引發(fā)。綜合本教研室以往研究和相關文獻報道,飲酒后促發(fā)TSAH的酒精毒理學作用主要為三大方面:其一,導致腦血管擴張,使之對顱腦部受力更敏感,而易于破裂出血;其二,抑制凝血和血管收縮,血管破裂后不能有效地發(fā)揮止血機制;其三,影響共濟協(xié)調(diào)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的反應性,使頸部肌肉松馳,躲避

2、或抵抗暴力能力差,頸部易過度旋轉(zhuǎn)和伸展,易發(fā)生椎動脈和基底動脈等顱內(nèi)血管損傷,且飲酒者處于更容易激惹而卷入爭斗的精神狀態(tài),被認為是酗酒后TSAH重要的引發(fā)因素。本研究旨在建立大鼠灌酒后TSAH模型基礎上,觀察腦組織腦紅蛋白(Ngb)、缺氧誘導因子1α(Hif-1α)表達及Na+,K+-ATPase活性的變化,從腦神經(jīng)元氧和能量代謝及鈉泵功能方面,探討酗酒對腦組織形態(tài)、代謝和功能的影響,及其與TSAH發(fā)生和死亡機理之間的相關機制,以期為此

3、類案件的法醫(yī)學鑒定和臨床防治提供科學理論依據(jù)。
　　材料與方法:
　　雄性SD大鼠,體重250~350g,隨機原則分為急性灌酒組、急性灌酒打擊組、急性灌酒死亡組、慢性灌酒組、慢性灌酒打擊組,急性灌酒又分為0.5h、2h、4h、6h、12h組,每組7只。急性組一次性灌北京二鍋頭(56％v/v)15ml/Kg,急性灌酒死亡組另予腹腔補充給酒,慢性組連續(xù)灌酒1個月,前2周予8ml/kg/次,后2周12ml/kg/次,每天兩次間隔8

4、h。對照組灌純凈水。打擊組灌胃后2h,予腦震蕩性損傷打擊。急性灌酒后不同時間、其它組灌胃或打擊后2h斷頭采血,取腦組織。急慢性灌酒及對照各另取一組檢測Na+,K+-ATPase活性。觀察灌酒大鼠生命體征,檢測血酒精濃度,HE及免疫組化染色觀察腦組織形態(tài)學及Ngb、Hif-1α表達變化,實驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析處理。
　　結果:
　　1、行為學和血酒精濃度變化
　　灌酒后0.5小時血酒精濃度為134.7

5、±4.5mg/dl,至2h達峰值188.8±5.8mg/dl,之后逐漸降低,12h后降至1.7±0.5mg/dl。灌酒大鼠短時間內(nèi)興奮性較強、不停走動,步態(tài)不穩(wěn),約0.5h后逐漸出現(xiàn)側臥、翻正反射消失,昏睡、呼吸緩慢、血壓降低等急性酒精中毒臨床表現(xiàn)。死亡組補充給酒后很快肢體癱軟,反應明顯減少,呼吸節(jié)律明顯變慢,呈間歇性深大呼吸,約4h后呼吸逐漸減弱至消失,心跳隨后停止。慢性灌酒大鼠毛發(fā)粗糙暗淡、精神萎靡,進食量減少,體重增長緩慢。

6、>　　2、TSAH、SAH發(fā)生率及死亡率
　　急性組TSAH發(fā)生率28.6%,無死亡及自發(fā)性SAH。慢性組TSAH發(fā)生率82.4%,死亡率為58.8%;自發(fā)性SAH發(fā)生率5.9%,無死亡。對照組未發(fā)現(xiàn)TSAH。
　　3、HE染色觀察
　　急性灌酒大鼠腦組織未見明顯病變,TSAH大鼠腦薄層斑片狀蛛網(wǎng)膜下腔出血,多見于腦干腹側。急性灌酒死亡大鼠神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞中至重度水變性,細胞周隙擴大。慢性灌酒大鼠腦組織表現(xiàn)為不同程度淤

7、血,TSAH大鼠大片較厚層蛛網(wǎng)膜下腔出血,神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞中重度水變性,胞核輕度固縮,多見嗜神經(jīng)現(xiàn)象,神經(jīng)元數(shù)量較正常組明顯減少(P<0.01),膠質(zhì)細胞增生。
　　4、Ngb、Hif-1α表達觀察
　　對照組大鼠腦神經(jīng)元內(nèi)Ngb較強表達,散在少量細胞Hif-1α輕度表達。急性各組Ngb陽性細胞數(shù)與對照組無差異,IOD值高于對照組(P<0.01),Hif-1α陽性細胞數(shù)與IOD值均高于對照組(P<0.01)。急性灌酒后Ngb

8、表達增強,2~4h明顯高,6h達最高,12h時仍維持較高水平;Hif-1α表達迅速增多增強,并維持較高水平至6h,12h時明顯回落,但仍高于對照(P<0.01)。急性灌酒死亡組Ngb IOD值與急性2~4h組無統(tǒng)計差異,Hif-1α表達增多增強(P<0.05)。慢性灌酒組額葉、海馬、腦干區(qū)Ngb陽性細胞數(shù)低于對照組(P<0.01),小腦區(qū)無差異,IOD值均較對照組高(P<0.01),較急性組低(P<0.05);Hif-1α陽性細胞數(shù)與I

9、OD值均高于對照組(P<0.01)。
　　5、Na+,K+-ATPase活性檢測:
　　正常大鼠額葉、海馬、小腦、腦干組織中Na+,K+-ATPase活性較高,急性灌酒組上述各區(qū)Na+K+-ATPase活性在0.5h有下降趨勢,2~4h較正常明顯降低(P<0.01),6h時開始恢復,12h后恢復正常。急性灌酒致死組各區(qū)Na+,K+-ATPase活性較正常和急性灌酒后2~4h組顯著降低(P<0.001)。慢性灌酒組各區(qū)Na+,

10、K+-ATPase活性較急性灌酒2h組高,較對照組低(P<0.05)。
　　結論:
　　1、建立了穩(wěn)定的大鼠急慢性灌酒后TSAH模型,證實酗酒與頭頸部輕微暴力協(xié)同作用促發(fā)TSAH及其死亡密切相關。提示酗酒后TSAH死亡案件在法醫(yī)學鑒定分析時,需充分考慮飲酒因素,輕微外力作用應屬于偶然條件致命傷,酗酒及其急慢性毒理作用屬于輔助死因。
　　2、證實了酒精及其代謝產(chǎn)物可影響腦組織神經(jīng)元Ngb氧攝取、運輸、利用的功能,使氧、能

11、量代謝及鈉泵功能障礙,可能參與酗酒后共濟失調(diào),以及醉酒精神狀態(tài)等CNS功能異常的機制,進而參與酗酒后促發(fā)TSAH。慢性灌酒組腦缺氧程度較急性組輕,可能與Hif-1α的誘導作用改善缺氧組織的氧供,Na+,K+-ATPase活性代償性增強有關。慢性灌酒組長期氧供和能量代謝障礙,鈉泵功能失常,導致神經(jīng)細胞損傷,提示其可能參與人類長期酗酒者的腦萎縮,及易發(fā)生嚴重腦外傷和預后差的內(nèi)在機制。
　　3、證實了急慢性灌酒后大鼠腦組織存在缺氧狀態(tài),